Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
4—2295
окрашенные вещества, то блок разрезают на сегменты в соответствии с видимыми зонами. Во-вторых, делают реплику* осторожно прижимая к поверхности блока полоску тонкой фильтровальной бумаги или пленку из ацетата целлюлозы, и быстро ее окрашивают. Обнаруженные на реплике зоны затем извлекают из блока. Наконец, можно весь блок разрезать на кусочки одинаковой ширины и определить распределение разделившегося материала, анализируя элюаты, полученные из сегментов. Элюцию проводят путем фильтрования через пористый стеклянный фильтр или центрифугирования в специальном приспособлении, состоящем из пластмассового стакана с перфорированным дном. На него сначала кладут диск соответствующей фильтровальной бумаги (например, ватман № 3), к которому прижимают сегмент блока, после чего сверху наслаивают несколько миллилитров буфера и все устройство помещают в центрифужную пробирку. Жидкость удаляется из поддерживающей среды в процессе центрифугирования при 300 g.
В аналитических целях электрофорез в гранулированной среде проводят не в блоках, а в тонком слое. Хамада и Ингбар [505] наносили тонкий слой певикона при помощи аппликатора фирмы Desaga, предназначенного для тонкослойной хроматографии. Они провели горизонтальный электрофорез образцов сыворотки крови человека, к которой были добавлены меченые тироксин или ЗДЗ-трииод-Ь-тиронин для количественного определения белков, связывающих эти вещества. После электрофореза слой певикона либо сразу высушивали и подвергали радиоавтографии, либо сначала окрашивали амидовым черным и выявленные зоны извлекали, а затем в них определяли радиоактивность.
Для двухмерного разделения веществ применяли также аналитический электрофорез в тонких слоях геля сверхтонкого се-фадекса в сочетании с гельфильтрацией [513].
1.8.2. Электрофорез в колонках
с гранулированной поддерживающей средой
Эта методика была предложена в начале 50-х годов, а разработанный для нее прибор подвергся с тех пор многим усовершенствованиям и модификациям. Согласно этой методике, электрофоретическое разделение проводят в колонке с гранулированной поддерживающей средой, а полученные зоны элюируют по окончании или в процессе электрофореза в коллектор фракций.
В литературе описано множество разновидностей колонок [142, 194, 388, 1020, 1024, 1214]. О конструкции одной из них
подробно рассказано в работе Пората и Иертена [1022]; более простой вариант этой колонки был позже предложен Поратом [1021]. Прибор должен включать следующие составные части: 1) трубку, образующую колонку с поддерживающим материалам; 2) трубки, соединяющие электрофоретическую колонку с электродными сосудами; 3) насадки для наполнения колонки и элюции зон после электрофореза.
В качестве примера рассмотрим устройство, предложенное Поратом [Ю21] (рис. 17). Оно представляет собой перевернутую U-образную систему трубок, соединяющую между собой два электродных сосуда. Одно колено системы состоит из электрофоретической колонки, окруженной охлаждающей рубашкой, другое — заполняется буфером и служит для обеспечения электрического контакта с колонкой, к нижнему концу которой может присоединяться воронка для собирания фракций. Внутрь колонки помещают вырезанную из листа пористой пластмассы втулку, имеющую вид маленькой чашечки с двойным дном. Два колена с жидкостью связаны друг с другом при помощи шлифа. В верхнюю часть колонки также вставляется шлиф с краном, через который подается буфер для ее промывания или элюции разделенных фракций. В стенке внутреннего шлифа сделано отверстие, а к наружному припаян штуцер так;ш образом, что при соответствующем повороте шлифа жидкость может проходить в боковой рукав. В колонке такой конструкции размером 55X2 см, заполненной сефадексом или целлюлозой в качестве поддерживающего материала, можно проводить электрофорез при напряжении 500—1000 В и силе тока 25—50 мА.
Электроосмос при колоночном электрофорезе создает известные трудности, так как может привести к выходу некоторых компонентов исследуемой смеси из колонки в пространство, заполненное буфером. Учитывая это, стартовую зону разделяемого материала целесообразно до начала электрофореза сместить током буфера на достаточное расстояние от верха колонки. Рекомендуется доба-
V
Рис. 17. Колонка для электрофореза в гранулированной поддерживающей среде [1021].
вить в пробу окрашенное вещество, чтобы следить за перемещением зон. Электроосмотический ток можно также скомпенсировать, создав поток буфера в направлении электрофоретического движения. Разумеется, скорость этого потока следует подбирать очень тщательно.
Промышленность выпускает несколько типов приборов для крупномасштабного колоночного препаративного электрофореза. Примером может служить колонка Пората фирмы LKB. Трубка в ней снабжена внутренним и внешним холодильниками. В ходе электрофореза сместившиеся ко дну колонки фракции можно извлекать, прокачивая буфер через специальные выводы. Этот метод был применен, в частности, для выделения траноферрина из сыворотки крови человека [405].
