Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 14. Кювета для микроэлектрофореза на ацетате целлюлозы (тип Microzone, фирма Beckman).
Х7,5 см, либо лист размерам 10ХЮ см. В обоих случаях можно одновременно анализировать восемь проб. В качестве поддерживающей среды в этой смеси используется пленка из ацетата целлюлозы, закрепленная на гибкой пластмассовой подложке (фирма Mylar). Полоски из такого материала более прочны и поэтому с ними легче обращаться. Для сканирования микроэлектрофореграмм необходимо иметь денситометр соответствующей чувствительности и разрешающей силы.
ПРЕПАРАТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА ПЛЕНКАХ ИЗ АЦЕТАТА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Пленки из ацетата целлюлозы сами по себе не пригодны в качестве поддерживающей силы для препаративного электрофореза, так как при увеличении количества нанесенного материала резко снижается разрешающая способность метода. Однако целлогель производится и в такой форме, которая удобна для препаративного разделения небольших количеств материала. Например, имеется целлогель в блоках размером 6X17 см и толщиной 2,5 или 5 мм. Их хранят в 30%-ном метаноле. Непосредственно перед электрофорезом блок вымачивают в течение по крайней мере 2 ч в соответствующем буфере и на стеклян-
ной пластинке подходящего размера помещают в электрофоретическую камеру. Концы блока соединяют с электродными сосудами при помощи фитилей из фильтровальной бумаги. Для получения стартовой зоны на поверхности блока по линейке выдавливают булавкой ряд канавок. Необходимо следить за тем, чтобы случайно не проткнуть блок насквозь. Кончик булавки следует погружать не глубже чем на 2 мм при толщине блока 2,5 мм. Если разделяемые вещества бесцветны, то положение полученных фракций определяют при помощи реплики, которую делают, осторожно прижимая к поверхности блока пропитанную буфером и наполовину высушенную полоску тонкого целлогеля или ацетата целлюлозы. Затем полоску быстро окрашивают, пока электрофорез в блоке еще продолжается. Если положение фракций на ней можно выявить, электрофоретическое разделение прекращают и блок разрезают на сегменты в соответствии с обнаруженной картиной. Разделенные вещества можно получить, отжимая эти сегменты в пресс-шприце (фирма Chemetron, Италия) или в обычном шприце. Согласно проспекту фирмы-изготовителя, в блоке целлогеля толщиной 2,5 мм можно фракционировать 0,25—0,4 мл сыворотки крови или 0,1 мл 3%-ного гемолизата эритроцитов.
1.8. Электрофорез в колонках и блоках
гранулированной поддерживающей среды
При исследовании биологических макромолекул эти методы широко применяются в препаративных и реже аналитических целях. Гранулированный материал, используемый для электрофореза, обычно представляет собой сухой порошок, связывающий на своей поверхности различные количества воды. К наиболее употребительным относятся порошки из стекла и пластмассы (поливинилхлорида или чаще сополимера поливинилхлорида и поливинилацетата), гранулированный крахмал и целлюлозный порошок. Можно также использовать суспензии гидратированных частичек геля, таких, как сефадекс или агароза, приготовленные в виде колонок или блоков.
Существует несколько критериев, по которым можно судить
о пригодности того или иного материала для электрофореза. Поддерживающий материал должен: 1) обладать хорошей устойчивостью к конвекции; 2) в достаточной степени проводить тепло, так как при слишком низкой теплопроводности трудно добиться удовлетворительного охлаждения системы; 3) не обладать значительной адсорбционной емкостью в отношении веществ, подвергаемых электрофорезу; 4) не иметь зарядов на поверхности частиц, так как они вызывают электроосмос. Устойчивость к конвекции возрастает гтри уменьшении размера частиц. Однако если гранулированный материал не абсолютно инертен по отношению к разделяемым веществам, то его адсорбционная емкость будет повышаться с уменьшением размера частиц. Во многих случаях необходимо идти на компромисс, принимая во внимание как свойства стабилизирующего материала, так и природу анализируемых веществ.
Преимущества стеклянного порошка заключаются в его довольно высокой теплопроводности и химической устойчивости. Однако он имеет большую адсорбционную емкость в отношении многих полиэлектролитов, особенно на свежих не обработанных поверхностях. Поэтому желательно работать с достаточно крупными частицами.
Целлюлозный порошок используется главным образом при электрофорезе в колонках. Этот материал обеспечивает очень хорошую стабильность электрофоретических зон даже при рых-
лой упаковке частиц. У него есть тенденция адсорбировать основные полиэлектролиты, но от этого можно избавиться путем этерификации карбоксильных групп или их восстановлением при помощи NaBH4 [1022].
Пластмассовые порошки, применяемые для зонального электрофореза, должны быть достаточно гидрофильными. Наиболее употребительным является сополимер поливинилхлорид— поливинилацетат, обладающий ничтожно малой способностью к адсорбции. Однако он хуже, чем целлюлозный порошок, стабилизирует зоны и отличается низкой теплопроводностью.
Набухшие частицы поперечно сшитых декстрановых гелей (сефадексов) очень эффективно препятствуют конвекции при электрофорезе. Порат [1020, 1021] рекомендует использовать сефадекс G-25 тонкий. Правда, при этом в щелочных растворах наблюдается небольшой электроосмотичеоюий ток, но его можно устранить, проведя предварительный этанолиз сухого геля. Адсорбция же растворенных макромолекулярных веществ обычно ничтожна.
