Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Сухие полоски или листы ацетата целлюлозы помечают мягким карандашом или шариковой ручкой, а затем осторожно кладут на поверхность буфера таким образом, чтобы они всасывали жидкость только снизу с помощью капиллярных сил. Нельзя сразу окунать сухие пленки в буферный раствор, так как при быстром погружении в их порах может остаться воздух. Полоски целлогеля, хранившиеся в разбавленном метаноле, долж-
ны находиться в буферном растворе в течение 10 мин. Не следует допускать высыханья пленок после их извлечения из раствора. Многие авторы рекомендуют аккуратно промокнуть их между листами фильтровальной бумаги. О высыхании свидетельствует появление на пленке белых пятен. В этом случае пропитывание необходимо повторить. Затем полоски или листы помещают на рамку, предназначенную для поддерживания их в горизонтальном положении во время электрофореза. В большинстве методик нанесение проб производят после установки рамки в камеру. Пробы можно наносить капиллярной пинеткой, проводя ею вдоль линейки, но, чтобы избежать при этом диффузии нанесенного раствора, требуется большая сноровка. Предприятия, выпускающие приборы для электрофореза на ацетате целлюлозы, включают обычно в комплект также приспособление для нанесения исследуемых проб. Некоторые из них действуют на том же принципе, что и описанное уже устройство для электрофореза на бумаге (рис. 12), но приспособлены для нанесения меньшего объема, который, как правило, должен быть в пределах 0,2—0,8 мкл/см. На целло-гель можно нанести и большие объемы, так как он выпускается в нескольких формах, различающихся по толщине. Имеются аппликаторы, рассчитанные на одновременное нанесение нескольких образцов. Мультиаппликатор фирмы Schandon Scientific Company представляет собой тонкую металлическую пластинку с вырезами по нижнему краю, образующими 10—16 прямоугольных зубцов с желобками, которые вмещают определенный объем жидкости при погружении их в исследуемые растворы, нанесенные пипеткой малыми порциями в отмеченные места на пластмассовой пластинке.
Оптимальное положение стартовой линии следует определить в предварительных опытах, так как оно влияет на картину разделения. Электрические параметры зависят от проводимости используемого буфера и подлежащего разделению материала. Как правило, при использовании пленок из ацетата целлюлозы, толщина которых бывает обычно около 120 мкм, сила тока не должна превышать 0,4—0,5 мА на 1 см ширины пленки. Если же применяют более толстые полоски целлогеля, то при обычной их толщине 250—300 мкм сила тока может достигать 1,0 мА на I см ширины.
После проведения электрофореза пленки из ацетата целлюлозы высушивают на воздухе при 80—100 °С. В этом нет необходимости, если разделенный материал можно надежно закрепить на пленке путем его осаждения с помощью какого-либо раствора. Например, большинство белков фиксируется на пленке при ее погружении на несколько минут в 5—7,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. Иногда осаждающий агент
включают в состав окрашивающего реактива, и тогда листы из ацетата целлюлозы помещают в него непосредственно после электрофореза.
Окрашенные электрофореграммы можно подвергнуть денситометрии путем сканирования в проходящем или отраженном свете. Для работы в проходящем свете пленки необходимо сделать прозрачными; для отраженного света это не обязательно, но результаты получаются лучше при сканировании прозрачных пленок на белом фоне. Пленки становятся прозрачными при пропитывании их минеральным маслом, обладающим одинаковым с ними коэффициентом преломления (rtd=l,47). Кроме того, многие, хотя и не все, пленки из ацетата целлюлозы можно сделать прозрачными при помощи агента, вызывающего набухание. Например, в инструкции фирмы Sartorius, выпускающей пленки, рекомендуется поместить их на стеклянную пластинку и погрузить на 3—5 мин в смесь диоксан— изобутанол, после чего высушить при 90—100 °С. Процедура обработки полосок целлогеля в соответствии с рекомендацией производящей фирмы включает их дегидратацию в течение 1 мин в чистом метаноле и последующее погружение на 1 мин в раствор, содержащий метанол, уксусную кислоту и глицерин (86, 14 и 0,1 мл соответственно). Затем пленки кладут на стеклянные пластинки и выдерживают при 60—70 °С до достижения прозрачности. Поскольку химическая устойчивость различных пленок неодинакова, целесообразно при их обработке следовать рекомендациям фирмы-изготовителя.
МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА АЦЕТАТЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Электрофорез на ацетате целлюлозы легко превратить в микрометод, просто сократив длину полосок или листов пленки. При этом объем пробы нужно уменьшить до 0,1—0,5 мкл и нанести его в виде короткого штриха длиной 5—6 мм. За короткий промежуток времени (20—40 мин) можно получить очень четкое разделение, применив относительно высокий градиент напряжения (30—40 В/ом). Грунбау'М и Кирк [493] сконструировали ячейку для микроэлектрофореза на ацетате целлюлозы. Впоследствии она была модифицирована [494] и в настоящее время производится фирмой Beckman (рис. 14). Ячейка представляет собой компактную ка*меру, снабженную сифонным устройством для выравнивания уровней буфера в электродных сосудах. Держатель вмещает полооки пленки длиной 60 мм или целый лист, рассчитанный на восемь проб. В продаже имеется и несколько других типов приборов. В аппарате модели Phoro-Slide фирмы Millipore в электрофоретическую кювету можно поместить либо четыре полоски каждая размером 2,5Х
