Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Электрофоретические кюветы типа влажной камеры можно разделить на две группы. В кюветах первой группы бумажные полоски свободно висят поверх опорной планки [1424] (рис. 10). Несколько вариантов таких устройств производится промышленностью. В другой группе кювет полоски или широкие листы бумаги натягиваются горизонтально между электродными камерами i[468] (рис. 11).
МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Бумагу погружают в буферный раствор, слегка промокают между чистыми листами промокательной или фильтровальной бумаги, а затем помещают на подставку, поддерживающую ее в соответствующем положении. Пробу наносят либо капиллярной пипеткой с закругленным носиком, либо с помощью различных аппликаторов, обеспечивающих быстрое и равномерное нанесение исследуемого раствора (рис. 12). При этом важно не поцарапать поверхность бумаги.
После нанесения проб к кювете подключают напряжение. Для наблюдения за ходом электрофореза на бумагу наносят пятно окрашенного стандартного вещества. По окончании процедуры бумагу быстро высушивают при 105—110°С (20—
30 мин). Макромолекулы затем можно обнаружить при помощи соответствующего метода окрашивания.
ПРЕПАРАТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА БУМАГЕ
Некоторые авторы [519, 1464] для препаративного электрофореза белков применяют толстую бумагу. Электрофорез следует проводить при температуре от +2 до +4°С. Затем бумагу разрезают на полоски в направлении, перпендикулярном направлению миграции. Белки извлекают либо с помощью элю-ции буферным раствором, либо выжимая под давлением жидкость из полосок. Положение зон может быть установлено до разрезания электрофореграм'мы путем получения реплики на тонкой фильтровальной бумаге и быстрого ее окрашивания (например, бромфеноловым синим). А можно просто разрезать всю бумагу на полоски и определить содержание белка в каждой из них. В этом случае, если выявление белка проводится путем регистрации оптической плотности при 280 нм, необходимо вероналовый буфер заменить на глициновый или борат-ный, так как веронал довольно сильно поглощает при этой длине волны. Было также предложено использовать в качестве препаративного метода непрерывный электрофорез на вертикальном листе бумаги [469], однако он едва ли применяется в настоящее время.
1.7. Электрофорез
на ацетате целлюлозы
Зональный электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы как по принципу, лежащему в его основе, так и по технике выполнения очень сходен с электрофорезом на фильтровальной бумаге. Различия между этими двумя методами заключаются в том, что в них используются поддерживающие среды с неодинаковыми свойствами,
Пленки из ацетата целлюлозы имеют однородную микропористую структуру, напоминающую микроскопическую губку, со средним диаметром пор, равным нескольким микронам. В них наблюдается намного менее выраженное расширение зон, чем на фильтровальной бумаге, характеризующейся весьма неоднородной разветвленной структурой. Пленки из ацетата целлюлозы отличаются высокой чистотой. Гемицеллюлозы и лигни-ны в них отсутствуют, а тяжелые металлы встречаются лишь в ничтожно малых количествах. Пленки из ацетата целлюлозы имеют значительно более низкую адсорбционную емкость для белков, чем бумага, поэтому в них не образуются «хвосты», наблюдающиеся при электрофорезе на фильтровальной бумаге. Фон после окрашивания получается бесцветным и «а нем четко выступают разделившиеся полосы. Эти преимущества позволяют попользовать электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы для исследования чрезвычайно малых количеств веществ, причем на проведение опыта приходится затрачивать меньше времени. К тому же ацетат целлюлозы является средой, пригодной для иммунодиффузии, и поэтому пленки из него можно применять для иммуноэлектрофореза (см. гл. II.4).
Первоначально пленки из ацетата целлюлозы были предназначены для фильтрования, а в качестве поддерживающей среды для электрофореза их впервые в 1957 т. рекомендовал использовать Кон [693]. С тех пор они нашли широкое применение. Пленки из ацетата целлюлозы несколько дороже фильтровальной бумаги, что во многих случаях препятствует их применению при электрофорезе вместо бумаги. Данный метод целесообразно использовать для разделения малых количеств веществ, особенно если принять во внимание, что он обладает также более высокой разрешающей способностью и требует
меньших затрат времени. В 60-е годы промышленность производила несколько типов приборов для микроэлектрофореза на ацетате целлюлозы. Тогда же была предложена модифицированная поддерживающая ореда — желатиниэированный ацетат целлюлозы, получивший название целлогеля (Ce'Ilogel). В отличие от обычных пленок из ацетата целлюлозы целлогель поставляется во влажном состоянии и должен храниться до употребления в 30%-ном метаноле.
ПРИБОРЫ
Электрофоретические кюветы, используемые для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы, аналогичны горизонтальным влажным камерам, применяемым для электрофореза на бумаге. Кон [694, 695] сконструировал кювету, вся площадь которой разделена на отсеки для буфера. Это сделано для того, чтобы воспрепятствовать чрезмерному испарению воды с поверхности пленки путем создания сплошной поверхности жидкости, обеспечивающей более эффективное насыщение парами всего объема прибора. Полоски или листы ацетата целлюлозы поддерживаются в нужном положении соответствующим мостиком, позволяющим варьировать длину пленки. Мостик, предложенный Коном, показан на рис. 13. Электроды делают из платиновой проволоки, проходящей вдоль всей ширины кюветы, снабженной герметически закрывающейся крышкой.
