Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Ни один из указанных способов не дает полного извлечения белков. От метода экстракции зависит как степень извлечения рибосомных белков, так и число зон, получаемых при их разделении [1180]. Эффективность этих методов зависит также, по-видимому, от источника исследуемых рибосом.
Пожалуй, наиболее полной экстракции рибосомных белков можно добиться путем разрушения структуры рибосом под действием ДСН [1375]. В этом случае рибосомные белки образуют комплексы с ДСН, которые можно подвергать электрофорезу в ДСН-содержащих гелях без предварительного удаления нуклеиновых кислот. В практическом отношении применение ДСН очень удобно, поскольку это позволяет анализировать небольшие количества рибосом или рибосомных субчастиц. Так, например, из фракций, полученных при центрифугировании в градиенте плотности, можно выделить рибосомные субчастицы путем осаждения ТХУ. Осадки после нейтрализации растворяют в буфере, содержащем ДСН [599], и белки разделяют электрофорезом в соответствии с их молекулярными массами.
Впервые успешное электрофоретическое разделение рибосомных белков было описано Уоллером [1369]. Электрофорез проводили в крахмальном геле, используя ацетатный буфер (pH 5,1) содержавший 6—8 М мочевину. В этой системе белки, экстрагированные из 70S-ph6ocom Е. coli, были разделены на 24 зоны. Электрофорез в крахмальном геле применяли также для разделения рибосомных белков млекопитающих [936, 1268].
Оказалось, что электрофорез в полиакриламидном геле обладает более высокой эффективностью, чем другие методы раз-
деления. Чаще всего для разделения рибосомных белков ис-пользуют буферную систему, которую предложили Райсфельд и др. [1072] и модифицировали Лебой и др. [750]. В этой неоднородной буферной системе разделяющий гель содержит 0,12 М калий-ацетатный буфер (pH 4,5), а концентрирующий гель —
0,06 М калий-ацетатный буфер с pH 6,8. Для обеспечения хорошей растворимости рибосомных белков ко всем буферным растворам и к гелям добавляют мочевину в конечной концентрации 6—8 М. Электродный буфер состоит из {5-аланина и уксусной кислоты (pH 4,3). В качестве маркерного красителя используют пиронин G (или Y). Концентрация полиакриламида в разделяющем геле может варьировать в широких пределах, обычно от 7,5 до 18%. Разрешение рибосомных белков повышается при обработке их 2-меркаптоэтанолом.
Перед электрофорезом белки, экстрагированные одним из указанных способов, необходимо подвергнуть диализу против раствора, содержащего мочевину и буфер концентрирующего геля или какой-либо сходный с ним буфер. В случае разрушения рибосом рибонуклеазами А или Т2 [1299] этот этап можно исключить.
Описанную выше систему применяли многие исследователи для разделения белков рибосом как прокариот, так и эукариот [391, 1298, 1299].
Фракционирование рибосомных белков очень часто проводят также и методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Первое успешное применение этого метода описано Уорнером [1375]. Рибосомы, белки которых были помечены радиоактивными изотопами, растворяли в 0,1 М фосфатном буфере, содержавшем 0,5% ДСН и 0,5 М мочевину, и наносили на поверхность разделяющего геля. В состав этого геля входили 10%-ный акриламид и буфер, применявшийся для растворения рибосом. После электрофореза гели разрезали и по радиоактивности определяли положение белков.
Шапиро и др. [1171] предложили сходную систему для разделения полипептидных цепей белков. В этой системе гель содержит 0,1 М фосфатный буфер (pH 7,1) и 0,1% ДСН. Буфер следует готовить из фосфатов натрия, так как ионы калия дают осадок с ДСН. Перед электрофорезом рекомендуется добавлять 2-меркаптоэтанол или другой восстановитель SH-rpynn. Описанная система с небольшими изменениями была использована многими авторами [119, 120, 456, 679, 1300] для определения молекулярных масс рибосомных белков.
Электрофорез рибосомных белков [414, 599, 846] можно проводить также в неоднородной буферной системе, впервые использованной при анализе белков бактериофага! Т4 [732]. (подробное описание см. в гл. II.2), Мы нашли, что эта си-
стема имеет более высокую буферную емкость, чем система, основанная на фосфатном буфере, поэтому при ее использовании отпадает необходимость в больших объемах или рециркуляции буфера. Добавление к буферным растворам и образцам мочевины в конечной концентрации 6 М улучшает разделение. Изоэлектрические точки рибосомных белков имеют довольно высокие значения и во многих случаях лежат при pH 10 или в более щелочной области [652, 1401]. В связи с этим ИЭФ данных белков имеет, по-видимому, относительно небольшое значение. Тем ,не менее Уэллеру и др. [1403] удалось разделить рибосомные белки на 50 зон путем ИЭФ в геле в присутствии амфолитов-носителей с интервалом pH 3—10. При исследовании радиоактивных белков из рибосом Е. coli они нашли, что 85 %: радиоактивности фокусируется в интервале pH 8,75—10.
Наилучшее разделение рибосомных белков было достигнуто при использовании методов двухмерного электрофореза. В этих методах вначале проводят электрофорез в цилиндрическом геле, который затем помещают в аппарат, где формируют пластину второго геля. Белки, разделенные в первом направлении, подвергают электрофорезу в направлении, перпендикулярном оси цилиндрического геля. Для получения хороших результатов необходимо при разделении во втором направлении изменить либо заряд белков, либо ситовые свойства геля, либо оба этих параметра.
