Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Поскольку мембранные белки дают довольно сложную электрофоретическую картину, при их исследовании применяют гели, обладающие свойствами молекулярного сита. Хотя есть примеры разделения мембранных белков с помощью электрофореза в крахмальном геле в присутствии мочевины [76, 522], большинство исследователей используют для этой цели элект-
рофорез в ДСН-полиакриламидных гелях, в которых белки разделяются в соответствии с их размерами. Методом электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле нередко анализируют также белки, солюбилизированные не ДСН, а другими агентами. Ниже приведено несколько систем, позволяющих разделять белки в зависимости от их размеров и заряда.
1. Система мочевина — уксусная кислота [921, 1270]. Белки растворяют в смеси фенол — уксусная кислота — вода 2:1: : 1 масса/объем/объем) и добавляют сухую мочевину до конечной концентрации 2 М. Состав геля: 7,5%-ный акриламид, 35%-ная уксусная кислота, 5 М мочевина. Гель полимеризуют в дистиллированной воде, а затем в течение 2 ч уравновешивают с раствором уксусной кислоты и мочевины [1270] (концентрирующий гель не используется). Электродным буфером служит 10%-ная уксусная кислота.
Невил [921] использовал неоднородную буферную систему. Разделяющий гель: 7,2% Т, 2,77% С, 0,58 М уксуоная кислота, 7,5 мМ КОН (pH 2,7), 9 М мочевина, 0,0004% рибофлавина, 0,05% персульфата аммония, 0,08% ТЕМЭД. Концентрирующий гель: 1,95% Т, 11,4% С, 0,065 М уксусная кислота, 0,06 М КОН (pH 5,9), 7 М мочевина, 0,0004% рибофлавина, 0,05% персульфата аммония. Верхний электродный буфер: 0,11 М глицин, 0,016 М уксусная кислота (pH 4,0), 6 М мочевина. Нижний электродный буфер: 4,6 М уксусная кислота, 0,06 М КОН (pH 2,7). Образцы содержали 8 М мочевину, 0,05 М К2СО3, 10% 2-меркаптоэтанола и следы метилового зеленого.
2. Система фенол — этиленгликоль — вода [1043]. Гели полимеризуют в воде и уравновешивают со смесью фенол — этиленгликоль— вода (3:2:3 масса /объем/объем) (pH смеси доводят до 4,6—5,0 муравьиной кислотой) или с раствором NaOH — фенол (pH 7,8; 0,1 М Na+).
Брауницер и Бауэр [165] применяли для электрофореза мембранных белков систему фенол — муравьиная кислота — вода.
Мембранные белки можно исследовать методом ИЭФ в присутствии мочевины [380, 863] или неионных детергентов. Хуанг и др. [588] солюбилизировали мембранные белки «эмуль-фагеном» (алкоксиэтиленоксиэтанол) и провели ИЭФ в 5%-ном полиакриламидном геле, содержавшем 0,25% детергента и 2% амфолинов (pH 3,5—10). Майнер и Хестон [875] для анализа нерастворимых белков мозга использовали 7%*ный полиакриламидный гель, содержавший 30% мочевины, 0,25% тритона Х-100 и 2,5% амфолинов (pH 3—10).
Бьеррум и Лундал [125] показали, что включение в среду различных неионных детергентов в концентрации не более 2% не влияет на иммунопреципитацию белков в агарозных гелях.
Исходя из этих данных, они исследовали белки мембран эритроцитов методом перекрестного иммуноэлектрофореза в агарозлом геле. Мембранные белки солюбилизировали 0,5% -ным раствором детергента ЕМИ-043, который включали также в агарозный гель в концентрации 1 %. Было получено 12 пиков преципитации, один из которых был идентифицирован как сывороточный альбумин. Лундал и Лильяс [787] анализировали белки мембран эритроцитов и одноклеточного паразита Achole-plasma laidlawii методом электрофореза в полиакриламидном геле (4% Т, 2% С) с последующим электрофорезом в агарозном геле, содержавшем антитела и 0,2% твина 20. Шмидт-Ульрих и др. [1137] солюбилизировали плазматические мембраны тимоцитов 1%-ным раствором тритона Х-100 и анализировали их белки путем перекрестного иммуноэлектрофореза в присутствии детергента (1%). Использование иммунной сыворотки морской свинки к микросомным мембранам тимоцитов кролика позволило обнаружить 11 пиков преципитации. При сочетании перекрестного иммуноэлектрофореза с лиганд-рецепторным взаимодействием были идентифицированы три компонента, связанные с конканавалином А. Агарозный гель, содержавший конканавалин А, формировали рядом с катодом, а гель первого направления помещали у анода. Конканавалин А, мигрирующий в геле к аноду, взаимодействовал с определенными белками, в результате чего пики преципитации этих белков сдвигались по направлению к аноду. Подобный эффект не наблюдался, если вместе с конканавалином А в гель добавляли 0,1 М а-метил-О-глюкопиранозид (один из сахаров, специфически связываемых лектином).
Берзине и др. [114] методом перекрестного иммуноэлектрофореза изучали антигены из микросом печени крысы, обладающие эстеразной активностью. Солюбилизацию белков осуществляли с помощью детергентов люброла и дезоксихолата. Вначале проводили ИЭФ (pH 3—7), а затем иммуноэлектрофорез в агарозном геле, содержавшем 10% кроличьей антисыворотки к микросомам печени крысы. Эстеразы идентифицировали по ферментативной активности согласно методу Уриэля [1323] (см. гл. II.6). В эстракте, полученном с помощью детергентов, обнаружили по меньшей мере 20 зон неспецифических эстераз, большинство из которых имели ИЭТ в интервале pH 4,5—6,5. При иммуноэлектрофорезе выявлено не менее 5 полос иммунопреципитации, обладающих выраженной микрогетерогенностью.
