Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Кроме того, для обнаружения пептидазной активности используют и хромогенные субстраты. Например, субтилизин определяют, погружая гели в забуференный раствор (pH 8,5) бен-зилоксикарбонил-глицин-глицин-Ь-лейцин-л-нитроанилида в 75%-ном диметилформамиде. После насыщения субстратом при 4°С (приблизительно в течение 30 мин) гели инкубируют еще 30 мин при 40 °С. Светло-желтые полосы, кажущиеся в ультрафиолетовом свете черными, указывают на присутствие активного фермента.
Был предложен метод специфического окрашивания трипсина и химотрипсина в результате расщепления ими хромогенных субстратов а-'Ы-бензоил-бЬ-аргинил-п-нитроанилида и N-аце-тил-Ь-тиронил-л-нитроанилида соответственно [304]. Гели обсушивают фильтровальной бумагой и помещают на бумагу ватман ЗММ, смоченную раствором субстрата в 10%-ном диметил-сульфоксиде. Через 5—15 мин в местах локализации ферментативной активности появляются желтые полосы.
Хотя различные производные нафталина и я-нитроанилина не являются природными субстратами протеиназ и пептидаз, на их основе можно разработать простые, быстрые и чувствительные методы обнаружения этих ферментов. Более того, огромное разнообразие таких соединений позволяет выбрать специфические субстраты для анализируемых ферментов.
Другой путь обнаружения пептидазной активности на крахмальном геле описали Иошида и Лин [1470], которые использовали в качестве вспомогательных ферментов L-аминооксида-
зу и пероксидазу по следующей схеме:
Пептидаза
Пептид
L-аминокислоты,
Оксидаза L-амиоокислот
L-аминокислоты
Н202 + NH3 + Кетокислоты,
Пероксидаза
Н202 + Дианизидин
Окисленный дианизидин + Н20.
В результате этой цепи реакций образуется коричневый осадок.
Природные субстраты протеаз также пригодны для выявления этих ферментов после электрофореза. Гели инкубируют с белками, а затем окрашивают и обесцвечивают обычными для белков методами. Бесцветные или слабо окрашенные полосы появляются в местах действия протеол'итических ферментов. Во многих случаях применяют окрашенные белки, что позволяет избежать трудоемких процедур окрашивания и обесцвечивания.
Протеолитическую активность можно обнаружить различными методическими приемами. Уриель [1322, 1323] погружал агаровые пластины в забуференный раствор белкового субстрата. Меркель [861] использовал хромопротеиды, выделенные из морских красных водорослей. Полоски ацетата целлюлозы после электрофореза помещали на пластины агара, содержащего субстрат. Эти ферменты после электрофореза на ацетате целлюлозы можно определять также с помощью индикаторного геля, включая в агаровый гель неокрашенные белки (например, казеин) [872].
Описаны приемы локализации протеолитической активности после электрофореза в крахмальном [655, 1120] и полиакриламидном гелях [57] с использованием методики включения субстрата в гель. Возможность применения этой методики для указанной цели была недавно изучена [37]. Чтобы предотвратить миграцию белкового субстрата во время электрофореза, эти авторы использовали в качестве субстрата казеин, осажденный кислотой. Нерастворимый казеин обрабатывали ультразвуком и образовавшиеся мельчайшие частицы смешивали с гелеобразующим раствором. Конечная концентрация казеина в геле составляла 0,1% (масса/объем). После электрофореза гель инкубировали в течение 2—12 ч при 37 °С в 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,5). Казеин пригоден только при электрофорезе в кислой среде, поскольку в щелочной среде он мигрирует. В этом случае вместо казеина можно использовать препарат гемоглобина, приготовленный путем осаждения и обработки ультразвуком. Окрашивание гелей белковым красителем (напри-, мер, нигрозином) увеличивало контрастность полос.
„ 7
По всей вероятности, для методики включений субстрата в гель пригодны белки, окрашенные ремазоловыл/ярким синим, так как эти производные белков нерастворимы/и были с успехом использованы в качестве субстрата при Определении про-теазной активности [923]. /
Для обнаружения предшественников активных протеолити-ческих ферментов вначале приходится инкубировать электро-фореграммы с ферментом, катализирующим активацию проферментов. Так, для активации трипсиногена можно применить энтерокиназу, а для активации химотрипсиногена — трипсин [304].
II.6.8. Лиазы
Многие из этих ферментов выявляют путем сочетания реакции» катализируемой данной лиазой, с реакцией, катализируемой вспомогательным ферментом. Например, альдолазу можно определить, подвергнув ее продукт, глицеральдегид-3-фосфат, действию глицеральдегиддегидрогеназы. Место, где произошла последняя реакция, обнаруживают затем одним из обычных спосообов определения дегидрогеназ. Несколько дополнительных примеров подобных методов приведено в табл. 8.
В некоторых случаях требуется более чем один вспомогательный фермент. Так, декарбоксилазу L-глутаминовой кислоты можно определить, используя в качестве вспомогательных ферментов трансаминазу 7-аминомасляной кислоты и сукцинат-дегидрогеназу [412].
