Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Полиакриламидные гели дают почти такое же разрешение гемоглобинов, как и крахмальные гели. Однако последние имеют некоторое преимущество, поскольку при их использовании для анализа требуется меньшее количество образца и меньшая продолжительность электрофореза. Очень полезны также мик-ро- и ультрамикромодификации электрофореза [132, 834]. Па-стевка и др. [975] не рекомендуют проводить фотополимериза-цию геля вместе с образцом, так как, по их данным, облучение
isii:
¦ - i :;i-'; Л ? * i: i У : r ¦ 0 I i Him
AG 9
Талассемця
88
Рис. P5. Изоэлектрическое фокусирование образцов, содержащих аномальные виды гемоглобина [691]. Образцы, расположенные слева и справа, использованы в качестве свидетелей, с помощью которых присутствующий в анализируемом образце (в середине) гемоглобин идентифицирован как D.
геля флуоресцентной лампой приводит к значительным искажениям электрофоретической картины. Эти авторы получили воспроизводимое разделение различных вариантов гемоглобина, наслаивая на гель образцы в растворе сахарозы. Ионы персульфата не влияли на разделение. Уильярд и др. [1430] применяли электрофорез в полиакриламидном геле для количественного определения гемоглобина Аг. После электрофореза гели разрезали, гемоглобин А2 экстрагировали феррицианид - ци-анидным реактивом и проводили фотометрию.
В последние годы более широкое распространение при фракциониро-
вании различных гемоглобинов получило изоэлектрическое фокусирование. Впервые возможность применения ИЭФ при разделении гемо'глобинов продемонстрировал Овеносон [1261, 1262], который попользовал для этой цели плавные градиенты pH. По вполне понятным причинам более широкому применению этого принципа способствовало развитие метода ИЭФ в гелях. Драйсдейл и др. [180] с помощью ИЭФ в трубках с полиакриламидным гелем добились разделения некоторых гемоглобинов человека, а также гемоглобином различных животных. Им удалось разделить гемоглобины А и FI (минорный компонент эмбрионального гемоглобина, содержащий ацетилирован-ные -у-цепи). В другой статье эти же авторы сообщили об исследовании гемоглобинов, имеющих различную степень окисления [182]. Они смогли не только отделить оксигемоглобин от ферригемоглобива, но и обнаружить две промежуточные зоны, содержавшие наполовину окисленные формы гемоглобина. Позже такой же подход использовали Шульман и др. [1148] при изучении продуктов биосинтеза гемоглобина в ретакулоцитах кролика с применением импульсной метки. При этом они нашли, что ©новь синтезированный глобин связан с окисленным ге-
мом. Дженсон и Бергланд [628] проводили ИЭФ в тонком слое' полиакриламидного геля. Образцы наносили на небольшие кусочки фильтровальной бумаги, ‘которые по;мещали на гель вблизи его катодного конца. Изоэлектрофокусирование проводили на охлаждаемой пластинке. В этой работе гемоглобин Мальмё был отделен от гемоглобина А, что не удавалось сделать с помощью электрофореза, так как эти белки слишком мало различаются по заряду (различие между ними заключается в замене одного остатка гистидина на остаток глутамина). Кепке и др. [691] тщательно изучили возможность использования ИЭФ для разделения вариантов гемоглобина человека (табл. 9), ИЭФ, по-видимому, обладает более высокой разрешающей способностью, чем электрофоретические методы, поскольку он позволяет разделить эа один прием больше видов гемоглобина, чем любой электрофоретический метод. Однако некоторые виды гемоглобинов трудно идентифицировать, если п-араллельно с образцами не подвергаются ИЭФ и стандартные препараты (рис. 98). Авторы подчеркивают, что, несмотря на превосходную разрешающую способность ИЭФ, в некоторых случаях возникает необходимость применения электрофореза.
С помощью электрофоретических методов можно также анализировать отдельные полипептидные цепи, составляющие молекулу гемоглобина. Такие анализы проводят для того, чтобы выяснить, в какой из цепей локализованы структурные изменения. Более того, электрофорез отдельных полипептидных цепей глобина иногда позволяет обнаружить такие варианты гемо-
Таблща 9
Изоэлектрические точки (ИЭТ) нормального и некоторых аномальных гемоглобинов, определенные при 37 °С методом изоэлектрофокусирования в пластинах полиакриламидного геля [691]
Тип гемоглобина Число исследованных И: ЭТ
образцов среднее значение стандартное
отклонение
С 36 7,28 0,015
Аг 90 7,22 0,025
S 43 7,10 0,014
D 6 7,08 0,006
G 7 7,05 0,007
F 69 7,00 0,015
А 98 6,93 0,016
Аз 91 6,83 0,012
