Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
После электрофореза на ацетате целлюлозы гиалуронидазу выявляли с помощью метода, который, по-видимому, является специфическим в отношении эндо-й-ацетилгексозамидиназ. Влажную электрофореграмму помещали на стеклянную пластинку и тщательно разглаживали чистой стеклянной пробиркой, чтобы удалить из-под нее пузырьки воздуха. Затем сверху накладывали полоску ацетата целлюлозы, насыщенную раство--ром, содержавшим 1 мг/мл гиалуроновой кислоты и фосфатно-цитратный буфер в 0,15 М NaCl (pH 5,0). Полоску раскатывали по поверхности геля и сверху помещали стеклянную пластинку. Полученный «сэндвич» инкубировали 30 мин во влажной атмосфере при 37°С. После инкубации верхний слой снимали, высушивали на воздухе и окрашивали в течение 1 мин алциано-вым синим в 7%-ной уксусной кислоте. Затем его промывали водой для удаления избытка красителя и вновь сушили. Белые полосы на равномерно окрашенном синем фоне указывали положение фермента [550].
II.6.6. Фосфатазы
Как уже отмечалось, фосфатазную активность можно обнаружить с помощью реакции азосочетания. С этой целью часто используют метод одновременного сочетания. Электрофореграммы инкубируют 15 мин при 25 °С в растворе, содержащем 25 мМ нафтилфосфат, 1 мг/мл соли прочного красного TR (диазотиро-ванный 2-амино-5-хлортолуол, ZnCb) и 33 мМ буфер трис-НС1 [15, 16]. После окрашивания гели промывают водой для удаления избытка красителя. Субстратами для щелочных фосфа-таз могут служит как а-, так и (J-нафтилфосфаты. При использовании реакционной смеси, содержавшей 3,74 г/л борной кислоты, 2,04 г/л MgCl2*6H20, 1 мг/мл соли прочного синего ВВ и один из нафтилфосфатов (pH доводят с помощью КОН до 9,7),
оказалось [1197], что метод обнаружения щелочных фосфатаз является более чувствительным, если в качестве субстрата берут (3-, а не а-нафтилфосфат.
Для локализации кислых фосфатаз применяют аналогичный метод [15, 26]. Гели инкубируют в растворе, содержащем
1 мг/мл натриевой соли а-нафтилфосфата и 1 мг/мл соли гранатового прочного GBC (диазотированный о-аминоазотолуол) в 50 мМ веронал-ацетатном или ацетатном буфере (pH 5,0). Реакцию останавливают путем погружения гелей в 7,5%-ную уксусную кислоту. Согласно некоторым данным [1174], а-нафтол, освобождающийся под действием кислой фосфатазы, можно также сочетать с солью прочного черного К (диазотированный л-нитробензолазо-2,5-диметилоксианилин). Так как существуют кислые фосфатазы, характеризующиеся термолабильностью, электрофорез и инкубацию следует проводить при 4—5°С. Для предотвращения реакций, катализируемых щелочными фосфата-зами, рекомендуется перед инкубацией с субстратом пропитывать гель буферным раствором с pH 5,0. Барка ,[86] рекомендует проводить инкубацию в течение 12—16 ч.
Для обнаружения фосфатаз разработан также метод другого типа, основанный на отщеплении под действием этих ферментов ионов фосфата [16, 458]. Гели инкубируют 15 мин при 25 °С в растворе, содержащем 50 мМ fj-глицерофосфат натрия (или другой фосфорный эфир), выполняющий роль субстрата, 15 мМ СаСЬ и 33 мМ трис-НС1 (pH 9,5). Затем гели промывают водой и помещают на 30 мин в раствор 3 мМ нитрата свинца в 80 мМ буфере трис-малеат (pH 7,0). После этой инкубации гели промывают несколько раз водой и погружают на 2 мин в 5%-ный раствор сульфида аммония для перевода осажденной соли свинца в сульфид. Наконец, гели промывают водой. Описанный метод можно также использовать для локализации кислых фосфатаз. В этом случае инкубацию следует проводить при pH 5,0 [15]. Дин и др. [285] предложили упрощенный вариант данного метода.
В методах, основанных на определении фосфата, освобождающегося под действием фермента, можно использовать любой субстрат, позволяющий обнаруживать специфические фосфата-» зы. Так, например, в одной из работ [929] субстратом служид фруктозо-1,6-дифосфат.
В качестве хромогенного субстрата фосфомоноэстераз применяют также n-нитрофенилфосфат |527]. Гели инкубируют 30 мин при 37СС с /г-нитрофенилфосфатом в 0,01 М буфере ими-дазол-НС1 (pH 7,4), содержащем смесь ионов металлов (Zn2+,. Mg2+, Со2+ и Мп2+ в соотношении 2 : 2 :1:1:, каждый в кон--центрации 1 мкМ). Положение фермента определяют па цоявлв' нию желтых полос. Использование этого субстрата позволяетг
проводить количественную оценку энзимограмм [536]. Однако в отличие от других рассмотренных выше методов определение фосфатаз по расщеплению /г-нитрофенилфосфата дает весьма ненадежные количественные данные, так как ферментные белки выпадают в осадок преимущественно лишь у поверхности геля.
Аналогичным образом можно выявить и фосфодиэстеразы, используя в качестве хромогенного субстрата бис-я-нитрофенил-фосфат [286].
Для определения фосфатаз применяют также п-толуидин-5* бром-4-хлор-З-индолилфосфат [306]. Интенсивные синие полосы появляются в тех местах, где находится фермент. Гели хранят в 7%-ной уксусной кислоте, не вызывающей обесцвечивания полос.
Спаркес и др. [1216] обнаруживали фосфатазную активность после электрофореза с помощью фенолфталеинмонофосфата. Гели инкубировали с этим субстратом, а затем выдерживали с концентрированным раствором аммиака, что способствовало развитию окраски образовавшегося фенолфталеина.
