Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Часто для локализации фосфатаз применяют флуорогенные субстраты. Гели инкубируют 10—20 мин с 4-метилумбеллифе-рилфосфатом, который непосредственно перед использованием растворяют в подходящем буфере. Флуоресценция освобождавшегося 4-метилумбеллиферона наблюдается при длине волны возбуждения 360 нм. Метилумбеллиферон растворим в воде и поэтому вымывается из геля. Гели, окрашенные этим субстратом, можно повторно окрасить нафтилфосфатом и солью прочного синего В fl!98].
Обнаружение и количественное определение фосфатазной активности проводят также с другим флуорогенным субстратом—нафтол-АЭ-МХ-фосфатом (2-окси-3-амидо-Ы- (2/,4'диметил-фенил)-нафталинфосфатом), который под действием фосфатаз превращается в сильно флуоресцирующее соединение. Инглис и др. [611] применили для этой цели метод индикаторного геля. Для его приготовления 2%-ный агар смешивают с равным объемом раствора 4 мМ .нафтол-АЭ-МХ-фосфата в 0,4 М 2-ами-но-2-метил-1-пропаноловом буфере (pH 11,2). После электрофореза пленки из ацетата целлюлозы кладут на пластину этого геля, тщательно разглаживая их, и инкубируют при 37 °С. При освещении пленок УФ-светом в тех местах, где произошла реакция, появляется флуоресценция. С помощью сканирующего устройства в УФ-свете можно проводить количественное определение фермента. Аналогичный метод был описан для выявления щелочных фосфатаз после электрофореза на ацетате целлюлозы [110].
Фосфодиэстеразы можно определять, подвергая продукты катализируемых ими реакций действию фосфатаз, применяемых
в качестве вспомогательных ферментов. Такой метод был использован Гореном и др. [452] для выявления циклонуклеотид фосфодиэстеразы после электрофореза в полиакриламидном геле. Гели инкубируют 30 мин при 25 °С в 5 мл раствора, содержащего 320 мкмолей 3',5'-сАМР, 2,5 единицы щелочной фосфа-тазы, 320 мкмолей буфера трис-малеат (pH 7,0), 10 мкмолей MgSC>4 и 12 мкмолей нитрата свинца; в процессе инкубации появляется белая полоса осадка. Затем гели промывают в течение 1 ч проточной водой и погружают на 2 мин в 5%-ный раствор (NH4)2S. После тщательного промывания водой гели можно хранить в воде.
Пирофосфатазную активность иногда определяют по образованию осадка в присутствии ионов кальция. В качестве примера можно привести метод выявления нуклеозидтрифосфатпирофос-фогидролазы [1372].
11.6.7. Пептидазы и протеиназы
Для обнаружения этих ферментов используют как природные, так и синтетические субстраты. В качестве синтетических субстратов чаще всего служат производные аминоацилнафтилами-да; образующийся под действием фермента нафтиламин вступает затем в реакцию азосочетания с солью диазония с образованием нерастворимого окрашенного соединения.
Подобные реакции с применением Ь-лейцил-4-метокси-р-наф-тиламида и соли синего прочного В были использованы для локализации лейцинаминопептидазы .[895]. Изоферменты «окси-тоциназы» обнаруживали при инкубации гелей с Ьгцистинил-ди-Р-нафтиламидом и солью прочного черного К [687]. С помощью аналогичного метода определяли изоферменты \-глутамилтранс-пептидазы сыворотки после электрофореза на целлогеле ,[977]. Полоску фильтровальной бумаги пропитывали раствором, содержавшим у-Ь-глутамил-р-нафтиламид, и накладывали «а полоску целлогеля. Через 30 мин после инкубации при 37 °С в закрытом бачке полоску целлогеля клали на фильтровальную бумагу, смоченную раствором соли прочного синего В, и инкубировали 30 мин в темноте.
При локализации специфических протеаз после электрофореза в геле были использованы N-бензоиларгининнафтиламид, N-глутарилфенилаланиннафтиламид и N-ацетилфенилалания-нафтиламид в качестве субстратов и соли прочного синего В или прочного гранатового GBC [1012] в качестве сопрягающих факторов. Для обнаружения пептидаз и протеаз применяли также аланин-^-нафтиламид в сочетании с солью фиолетового прочного BN и множество других комбинаций субстратов подобного типа и сопрягающих агентов. Во всех, этих методах час-
то используют процедуру одновременного сочетания. Концентрация субстрата обычно составляет около 1 мМ, sf концентрация сопрягающего агента 1—2 мг/мл. Буфер для инкубационной среды подбирают в зависимости от оптимума pH исследуемого фермента. /
Метод сочетания после инкубации также/ применяют для локализации'протеаз, например катепсинов [28]. Полиакриламидные гели инкубируют 3—5 мин при 40 °С в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 1,33 мМ ЭДТА, 2,65 мМ цистеин и 0,8 мг/мл бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-4-метоксинафтиламид-хлорид. Субстрат перед добавлением к инкубационной смеси растворяют в 0,1 мл диметилсульфоксида. Чтобы выявить 4-ме-токсинафтиламид, освобождающийся под действием фермента, гели переносят в раствор прочного гранатового GBC (1 мг/мл) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. В эту инкубационную среду включают также 25 мМ ЭДТА и 5 мМ 4-хлормеркурибензоат (причины, по которым эти соединения должны присутствовать в растворе, см. [87]). Темно-красные полосы на бледно-желтом фоне указывают местоположение катепсина Вь
