Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 128

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 185 >> Следующая

Электрофорез на ацетате целлюлозы служит простым и вместе с тем чувствительным способом обнаружения аномальных видов гемоглобина. Наиболее подходящей буферной системой является смесь трис-борная кислота-ЭДТА (pH 8,4) [816, 1141, 1224]. Для качественных анализов можно использовать микрометоды. Электрофореграммы анализируют либо без применения красителей, либо после их окрашивания общими белковыми красителями или с помощью пероксидазы. Последний метод, очевидно, более специфичен, так как выявляет только те белки, которые содержат гем. Шнейдер [1141] рекомендует двукратное окрашивание: сначала пунцовым S, а затем раствором бензидина, содержащим нитропруссид натрия (дает синюю окраску). Если при электрофорезе необходимо определить содержание минорного (т. е. имеющегося в незначительном количестве) компонента, например гемоглобина Аг, то наиболее надежный метод состоит в том, что на пленку наносят относительно большое (точно определенное) количество образца, элюируют соответствующие зоны электрофореграммы без ее предварительного окрашивания и проводят фотометрическое измерение [1141]. При денситометрическом сканировании окра-
шенных или неокрашенных электрофореграмм получают менее воспроизводимые результаты.
С помощью электрофореза на ацетате целлюлозы легко можно разделить целый ряд различных видов гемоглобина человека, например гемоглобины A, F, S и С. Однако при электрофорезе в щелочных условиях нельзя отделить HbS от других гемоглобинов, имеющих сходный заряд, а также НЬС от тех вариантой гемоглобина, которые, подобно НЬС, отличаются от НЬА на два заряда (НЬЕ и НЮ). Из-за незначительных различий в подвижностях гемоглобинов А и F трудно обнаружить небольшие количества НЬА в присутствии больших количеств HbF, и наоборот. Шмитд и Холланд [1136], проводившие оценку готовых наборов, предназначенных для электрофореза гемоглобинов (на ацетате целлюлозы), подчеркивают, что на каждую пластинку ацетата целлюлозы следует наносить набор свидетелей, содержащий гемоглобины A, F, S и С. Они также пришли к выводу, что некоторые партии ацетата целлюлозы дают плохие результаты. Шмидт и Брозиус [1135] обращают внимание на тот факт, что источником ошибок при тестах на аномальные виды гемоглобина нередко является неверная интерпретация электрофоретической картины. Поэтому считают необходимым при определении фенотипа гемоглобина использовать по меньшей мере два метода, например электрофорез при разных pH или электрофорез при одном значении pH в сочетании с тестом на растворимость HbS.
Второй наиболее важный электрофоретический метод — это электрофорез в агаровом геле при pH 6,0—6,5 [ПОЗ]. В исходном методе рекомендуется наливать 1%-ный раствор агара в цитратном буфере на стеклянные пластинки размером 22Х Х13 см. Образцы наносят на маленькие кусочки фильтровальной бумаги, которые помещают в щели, вырезанные в агаровом геле, или просто накладывают на поверхность геля, и после того, как белки проникнут в гель, начинают электрофорез. Шнейдер [1141] описал метод электрофореза на предметных стеклах в агаровом геле, забуференном цитратом. Образцы наносят на гель в виде круглого пятна. Кроме того, на каждую пластинку следует наносить стандартный гемолизат (содержащий, как правило, HbAS), поскольку положение компонентов варьирует в зависимости от величины электроэндосмоса. При перемещении к катоду гемоглобины располагаются в следующем порядке: HbF>HbA>HbS>HbC. Та же закономерность наблюдается и в отношении растворимости гемоглобинов при pH 6,0. Основное преимущество этого метода электрофореза состоит в том, что он позволяет отделять НЬС от НЬЕ и HbS от HbD, а также определять малые количества НЬА в присутствии HbF. Многие мутантные виды гемоглобина (G, D, Е, О, I
и др.) мигрируют в этой системе вместе с НЬА. Леман и Хунц-ман [753] обращают внимание исследователей на большие различия между разными марками агара. Шнейдер и др. [1143] предложили модификацию электрофореза в цитрат-агаровой системе. Они применяют пластинки из ацетата целлюлозы на миларовой подложке, пропитанные забуференным агаром. Пластинки ацетата целлюлозы вымачивают 1 ч в воде, дают воде стечь и слегка их подсушивают фильтровальной бумагой. Затем пластинки помещают в штатив в вертикальном положении, погружают в 1%-ный раствор агара в 0,05 М цитратном буфере (pH 6,0) и выдерживают 30 мин при 60 °С. После этого дают стечь избытку агара и переносят каждую пластинку в отдельный герметично закрывающийся пластмассовый пакет, содержащий небольшое количество буфера. В такой упаковке пластинки можно хранить в холодильнике длительное время. Очень важно быстро наносить образцы на пластинки, чтобы избежать опасности их высыхания во время всех этих манипуляций. Поскольку пластинки покрыты очень тонким слоем агара, при электрофорезе можно применять высокое напряжение, что позволяет уменьшить время разделения.
Для электрофореза гемоглобинов широко используют также крахмальный и полиакриламидный гели. При разделении разных форм гемоглобина характерный для этих гелей эффект молекулярного сита не играет никакой роли, в то же время их превосходные стабилизирующие свойства имеют очень важное значение, так как благодаря этим свойствам диффузия в гелях ограниченна, что облегчает разделение компонентов, лишь слегка различающихся по электрофоретической подвижности. Для повседневных анализов гемоглобинов рекомендуется использовать систему трис-борат-ЭДТА, а для разделения минорных гемоглобинов с низкой подвижностью лучше применять неоднородную систему трис-цитрат-ЭДТА [334]. Для обнаружения аномальных метгемоглобинов все присутствующие в образце гемоглобины переводят в восстановленную форму и затем проводят электрофорез при pH 7,0—7,1 [430]. Гемоглобин Н можно отделить от гемоглобина Барта и гемоглобина I с помощью электрофореза в фосфатном буфере при pH 7,7 (это значение pH является критическим) [592].
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed