Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Описан быстрый и чувствительный метод идентификации холинэстеразы после электрофореза в полиакриламидном геле [495]. Субстратом для этого фермента служил N-метилиндок-силацетат. N-метилиндоксил, образующийся в результате ферментативной реакции, превращается под действием молекулярного кислорода в N-метилиндиго зеленый. В кислой и щелочной среде полосы фермента быстро обесцвечиваются, но » буфере трис-HCl или фосфатном буфере (pH 7,0) они не изменяются; поэтому гели можно хранить в этих буферных растворах. N-ме-тилиндоксилацетат гидролизуется также ферментами нехолин-эстеразного типа [338].
Кунерт и Хейманн [726] для определения эквивалентной массы микросомных карбоксиэстераз с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН пометили их 14С-бис-4-нитро-фенилфосфатом.
Для окрашивания специфических эстераз можно использовать индикаторы pH. Огита [938] помещал агаровые гели в раствор, содержавший в 100 мл воды 0,2—0,4 г субстрата, 21 мг NaHC03 и 0,02 % бромтимолового синего (добавленного в виде 1%-ного раствора в этаноле). После инкубации в течение 30мин при комнатной температуре гели выдерживали в насыщенной водой атмосфере до тех пор (30—120 мин), пока эстеразы не выявлялись в виде желтых полос на зеленовато-голубом фоне.
Ацетилхолинэстеразу можно окрасить непрямым способом, используя два геля, нагруженные одним и тем же образцом. После электрофореза один из гелей окрашивают часто используемым нафтилацетатом и сопрягающим агентом. Второй гель инкубируют в тех же условиях, но в присутствии 10 мкМ эзе-рина [1450].
Для локализации гликозидаз в качестве хромогенного субстрата применяют о- или п-нитрофенилгликозид [417]. Положение фермента определяют по образованию желтой полосы. Глюкозаминидазу также можно выявить с помощью субстратов
этого типа, таких, как о-нитрофенил-М-ацетил-р-О-глюкозами-дин.
Гликозидазы выявляют и с помощью реакции азосочетания. Так, например, p-глюкуронидаза была идентифицирована после диск-электрофореза «методом сочетания после инкубации» с использованием нафтол-АЭ-ВЬ'Р-О-глюкуронида и диазотирован-ного я-розанилина [663]. Появление красных полос на светло-желтом фоне указывало местоположение фермента. Через несколько часов фон становился красновато-коричневым.
В другом методе аутохромным субстратом р-глюкуронидазы служил 5-броминдол-3-ил-,р-0-глюкуронат [1471]. Гели инкубировали при 38 °С в 0,4 М ацетатном буфере (pH 4,5), содержавшем указанный субстрат в 1 мМ концентрации. Полоса темносинего цвета соответствовала положению ферментативной активности. Фон оставался неокрашенным.
При обнаружении гликозидаз часто используют также производные 4-метилумбеллиферона как флуорогенные субстраты. Например, 4-метилумбеллиферил-а-Ь-фукопиранозид был применен для окрашивания фукозидазы после электрофореза в крахмальном геле [1314] и изоэлектрического фокусирования на пластинах полиакриламидного геля [1288]. На поверхность гелей накладывали хроматографическую бумагу, пропитанную раствором, содержавшим 1 мМ 4-метилумбеллиферил-«-Ь-фуко-зид в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере (pH 5,5), и проводили инкубацию при 37 °С. Освободившийся умбеллиферон можно было обнаружить, просматривая отпечаток в УФ-свете. При обработке поверхности геля 0,5 М NaOH-глициновым буфером (pH 10,4) интенсивность флуоресценции увеличивалась [1288]. Метод, предложенный Тёрнером и др. ^ 1314], очень сходен с описанным выше, за исключением состава и концентрации буферных растворов.
В продаже имеется много других метилумбеллиферилглико-зидов, поэтому данный метод можно считать универсальным способом обнаружения специфических гликозидаз.
Амилазную активность после электрофореза в полиакриламидном геле иногда выявляют с помощью метода индикатор' ного геля. Гели помещают на пластину крахмала, приготовлен' ную из 4%-ного гидролизованного крахмала в буферном рас~ творе, состоящем из 0,02 М борной кислоты и 0,01 М NaOH [668]. Затем гели инкубируют при 37 °С 15—30 мин (если для разделения панкреатических ферментов используют катионную систему) или 0,5—5 мин (в случае анионной системы). После инкубации крахмальную пластинку фиксируют и обрабатывают йодной кислотой и реактивом Шиффа.
Изоферменты а-амилазы из сыворотки человека были разделены методом электрофореза в агаровом геле [1332]. По окон-
чании электрофореза гели накрывали пластинкой, содержавшей 1% агара, 1% крахмала и 0,05%. NaCl. Этот «сэндвич» инкубировали 1 ч при 37°С, после чего крахмально-агаровый гель удаляли и агаровую пластинку окрашивали раствором люголя. Полосы, окрашенные менее интенсивно, чем остальной гель, указывали положение фермента.
Для локализации амилазы был также использован метод включения субстрата в гель: перед полимеризацией акриламида к нему добавляли растворимый крахмал [406, 1465]. После электрофореза гели инкубировали 5 мин при 37 °С в 0,1 М ацетатном буфере (pH 6,0) и окрашивали 0,1%-ным раствором •иода в иодистом калии, содержавшим 1 н. уксусную кислоту. В тех местах, где находилась такаамилаза, появлялись бесцветные полосы на фиолетовом фоне [1465].
