Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Все методы, включающие на втором этапе электрофорез в геле с ДСН, дают возможность определять молекулярные массы белков, присутствующих в разделенных зонах. Другой подход к определению молекулярных масс рибосомных белков описали Бикль и его сотрудники [119, 120]. После двухмерного разделения рибосомных белков в системе без ДСН центральную часть каждой зоны вырезают, белки элюируют буфером, содержащим 6 М мочевину и 1 % ДСН, и подвергают их электрофорезу в геле с ДСН.
Для обнаружения рибосомных белков после электрофореза можно использовать любой применяемый после электрофореза в геле метод выявления белков (например, окрашивание амидо-вым черным 10 В, кумасси ярким синим R-250 или G-250, а в случае радиоактивных белков -радиоавтографию). Недавно
специально для рибосомных белков [595] был описан метод, основанный на высоком сродстве ауринтрикарбоновой кислоты к основным рибосомным белкам. Метод позволяет исключить традиционное окрашивание и обесцвечивание гелей. Перед электрофорезом к раствору рибосомных белков добавляют ау-ринтрикарбонат в концентрации 2,5-10—5—25-10-5 М (в зависимости от концентрации белка). При разделении рибосомных белков в буферной системе с pH 4,3 ауринтрикарбоновая кислота может также служить внутренним маркером. Комплексы белков с ауринтрикарбоновой кислотой разрушаются в присутствии ДСН, поэтому наличие красителя не мешает разделению белков при электрофорезе во втором направлении в присутствии ДСН.
II.7.3. Мембранные белки
В последние годы изучение структурных компонентов мембран является одним из основных направлений биохимии. Благодаря высокой разрешающей способности электрофорез (в особенности электрофорез в полиакриламидном геле) служит одним из наиболее важных методов исследования этих компонентов. Так как число мембранных белков очень велико и все они обладают низкой растворимостью в воде, возникает ряд проблем, не встречающихся в других областях биохимии. Поэтому вопросы, связанные с солюбилизацией мембранных белков перед электрофорезом, приобретают большое значение и требуют более подробного рассмотрения.
СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ
Некоторые мембранные белки растворяются в дистиллированной воде [192, 844] или забуференных растворах [812, 814, 889]. Для частичной солюбилизации мембранных белков была использована их обработка 33%-ным раствором пиридина с последующим диализом против дистиллированной воды [137]. Белковые компоненты базальной мембраны почечных клубочков человека можно избирательно солюбилизировать с помощью хаотропных агентов [825]. Почти все мембранные белки переходят в растворимое состояние в этаноле, содержащем 1% уксусной кислоты [849].
Для освобождения белков из мембран используют также химические реакции белков с дииодсалицилатом лития [813] или ангидридами янтарной [1114] малеиновой и цитраконовой кислот [189, 342]. Реакция цитраконилирования заслуживает особого внимания, поскольку она позволяет солюбилизировать
около 70% мембранных белков, причем цитраконовые группировки можно затем удалить в слабокислых условиях.
При обработке мембран сильными диссоциирующими агентами, например б М хлористым гуанидином [497], 8 М мочевиной в присутствии 2-меркаптоэтанола [591], смесью фенол—уксусная кислота — вода (2:1:1 масса/объем/объем), содержащей
2 М мочевину [248, 1270], или 88%-ной муравьиной кислотой [896, НМ], солюбилизируется 50—100% мембранных белков.
Для выделения мембранных белков широко используют детергенты, способные замещать липидную часть липопротеидов. Показано, что дезоксихолат натрия солюбилизирует 60—80% мембранных белков [828]. Миллер [869] сообщил, что в присутствии неионного детергента тритона Х-100 растворяются все белки мембран эритроцитов [869]; однако, согласно более поздним данным [287, 761], этот агент освобождает лишь часть мембранных белков. Тритон Х-100 не вызывает инактивации ферментов [77, 1190], и в его присутствии можно проводить как ИЭФ [875], так и электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН [287].
Наиболее широко распространенным детергентом, применяемым для солюбилизации мембран, является ДСН. В концентрации более 1% он переводит в растворимую форму, по-видимому, все мембранные белки бактериальных [613] и эукариотических [358, 755, 829, 896] клеток. При использовании ДСН в более низких концентрациях достигается лишь частичная солюбилизация мембранных компонентов [781], что позволяет фракционировать белки в соответствии с растворимостью их комплексов, образующихся при разных концентрациях ДСН [167]. Присутствие мочевины [766, 776] и обработка ультразвуком [1041] способствуют солюбилизации белков в ДСН.
На основании рассмотренных выше данных можно сделать вывод, что различные растворители в разной степени солюбилизируют мембранные белки, т. е. каждый растворитель экстрагирует определенную группу белков. Из сказанного следует, что последовательная экстракция мембран различными солюбилизирующими агентами обеспечивает предварительное фракционирование белков перед электрофорезом.
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ АНАДИЗА МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ
