Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ТОПОГРАФИЯ БЕЛКОВ В МЕМБРАНАХ
Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле в сочетании с некоторыми методами химической модификации является пре-зосходным способом изучения топографии белков в мембранах,
поскольку он позволяет прямым путем обнаруживать различия в молекулярных масса.х белков. В качестве модифицирующих агентов применяют протеолити-ческие ферменты, сшивающие агенты и радиоактивные вещества.
Если мембраны инкубируют с протеолитическими ферментами, а затем выделенные из них белки подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с ДСН, то наблюдают изменения в подвижности некоторых белков, а именно тех, которые в составе мембран стерически были доступны действию ферментов.
Обработка мембран сшивающими агентами (такими, как,
диметилсуберимидат [594, 781],
формальдегид, глутаровый аль-
дегид [1227] или диметиладипи-мидат [629]) приводит к формированию межмолакулярных связей между белками, расположенными в мембранах близко друг от друга. Образующиеся при это'М высокомолекулярные со-
единения можно обнаружить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН. На рис. 97 показано, что в процессе обработки мембран формальдегидом некоторые белки (обозначенные как 2-1, 2*2, 2*3 и 4-2) постепенно исчезают и вместо них появляются новые зоны, расположенные в области высокомолекулярных белков.
Локализацию белков в мембранах изучают также с применением радиоактивных реагентов. Если реакция протекает лишь на поверхности мембран, ш те белки, которые локализованы i
Puct 97. Влияние формальдегида* на белки мембран эритроцитов человека [1228], Тени эритроцитов инкубировали с формальдегидом в течение 30 мин при комнатной температуре и затем анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН. Образцы 1—4 содержали соответственно 0, 5, 10 и 15 мМ формальдегид. МК — маркерный краситель (пиронин Y); НЬ — диссоциированные полипептидные цепи гемоглобина.
ными оказываются только' поверхности, и эти белки
можно обнаружить методом электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН. Среди многочисленных способов введения радиоактивной метки [55, 418, 997, 1091] наиболее широко используется иодирование с помощью лактопероксидазы [265, 588,
1003].
11.7.4. Гемоглобины человека
Благодаря исключительно важной биологической роли и легкой доступности гемоглобинов их изучение электрофоретическими методами началось уже очень давно. Эти исследования привели ко многим фундаментальным открытиям в области молекулярной и медицинской генетики. Поскольку целый ряд тяжелых заболеваний человека обусловлен точковыми мутациями в генах, кодирующих цепи гемоглобина, электрофоретические исследования гемоглобинов имеют важное значение не только для решения фундаментальных проблем, но и при клинических анализах. У животных тоже обнаружена множественность электрофоретических форм гемоглобина, а для некоторых видов установлен генетический полиморфизм.
На ранних этапах исследования гемоглобинов применяли электрофорез с подвижной границей, а также электрофорез на бумаге и в блоках крахмального геля. С помощью этих методов были выявлены первые мутантные гемоглобины. В настоящее время в качестве носителей при электрофорезе используют ацетат целлюлозы, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели. Кроме того, все более широкое распространение получает изоэлектрическое фокусирование.
Источником гемоглобина может служить любой образец свежей крови, обработанный антикоагулянтом. Для приготовления гемолизатов используют также капиллярную кровь. Осажденные эритроциты трижды промывают солевым раствором (3— 5-кратный объем по отношению к осадку). Гемолиз проводят в стеклянных пробирках, добавляя к клеткам 1—1,5 объема дистиллированной воды и 0,4 объема ССЦ. Смесь встряхивают
4 мин и центрифугируют. Прозрачную надосадочную жидкость затем фильтруют через фильтровальную бумагу и разбавляют до нужной концентрации [598, 753]. Лизис клеток можно ускорить, добавив после дистиллированной воды небольшое количество сапонина или путем их замораживания и оттаивания в дистиллированной воде. Однако обработка клеток вторым способом приводит к осаждению гемоглобина Н. Этот аномальный гемоглобин и некоторые другие нестабильные гемоглобины могут денатурироваться во время интенсивного встряхивания с ССЦ. Для предотвращения денатурации таких гемоглобинов содержащие их эритроциты лизируют в 4 объемах дистиллирован-
ной воды и остатки разрушенных клеток удаляют с помощью высокоскоростного центрифугирования. Описанная методика приготовления растворов гемоглобина для электрофореза довольно проста и позволяет получать гемолизаты, свободные от лейкоцитов и тромбоцитов. Однако массовые обследования требуют максимально простых и быстрых методов. Для этой цели была предложена упрощенная методика с использованием центрифугирования в смеси сахарозы и детергента [1158]. Она дает хорошие результаты, но не позволяет получать гемоглобин Н (П. Кингстон, личное сообщение, цитируемое Хунцманом [598]). Некоторые авторы используют образцы цельной крови для электрофореза гемоглобинов на ацетате целлюлозы. Лизис клеток осуществляют, включая лизирующий агент либо в образец крови, либо в буфер, которым пропитывают пленку ацетата целлюлозы [343, 437]. Образцы крови можно также высушивать на фильтровальной бумаге и помещать эти бумажные полоски на ацетат целлюлозы [532]. Шнейдер и др. [1143] применяли лизирующий реагент (содержавший в 1 л 2,5 г ЭДТА и 50 кг KCN) для лизиса неотмытых эритроцитов. Гемоглобин, подвергаемый электрофорезу, может использоваться в виде оксигемоглобина, карбоксигемоглобина (полученного путем насыщения раствора оксигемоглобина оксидом углерода СО) или цианметгемоглобина (полученного из оксигемоглобина путем его обработки феррицианидом, а затем цианидом) [1141]. Все сравниваемые образцы следует наносить в какой-либо одной форме.
