Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Электрофореграммы гистонов имеют сложный характера Примерно 10 зон содержат 96% всех гистоновых белков, которые не обладают тканевой специфичностью [361, 963, 1233]. Гистоны, богатые аргинином, по-видимому, не подвергались изменениям в процессе эволюции, а в гистонах, умеренно обогащенных лизином, замещения происходили несколько чаще. В то же время гистонам, богатым лизином, в значительной мере свойственна видовая специфичность [164, 360, 965, 1237, 1244].
Негистоновые белки хроматина обычно исследуют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН. Одни и» этих белков обладают, очевидно, тканевой специфичностью* [1088, 1461], тогда как другие представляют собой, вероятно,, ферменты, имеющие общие для всех тканей структурные компоненты [337].
В то время как молекулярная масса гистонов не превышает 40 000 [117, 118], негистоновые белки хроматина (по данным электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН) характеризуются большой молекулярной массой (до 180 000) [1282].
Иомен и др. [1468], а также Оррик и др. [943] разделили суммарные белки из ядер печени крыс и асцитной гепатомы Новикова методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле. В первом направлении электрофорез проводил» в 10%-ном полиакриламидном геле, содержавшем 0,9 М уксус-
Рис. 96. А. Двухмерный электрофорез ядерных белков нормальной печени [943]. Электрофорез в первом направлении проводили в цилиндрических гелях, содержавших 10%-ный акриламид и б М мочевину, а во втором — на пластине геля, содержавшего 12%-ный акриламид и 0,1%-ный ДСН. Белки окрашивали кумасси ярким синим. Цифрами указаны зоны, отличающиеся по интенсивности окраски от тех же зон на электрофореграмме белков гепатомы Новикова. Б. Схематическое изображение электрофореграммы, представленной на рис. 96, А. Черные пятна обозначают наиболее интенсивно окрашенные зоны, .заштрихованные*—менее интенсивно окрашенные, светлые кружки — очень слабо окрашенные зоны, а пунктирные кружки — минорные компоненты.
ную кислоту и 4,5 М мочевину. Для второго направления использовали полиакриламидный гель, содержавший ДСН. Интересно отметить, что картины, полученные при разделении белков из ядер этих двух типов, оказались весьма сходными и обнаруживали лишь некоторые количественные различия (рис. 96).
Было осуществлено [790] двухмерное разделение негистоно-вых белков хроматина (ИЭФ в присутствии мочевины в первом направлении и электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН во втором). Авторы обнаружили, что изоэлектрические точки этих белков лежат в интервале pH 2—6, а молекулярная масса составляет 15 000—200 000. По-видимому, лишь некоторые из этих белков обладают тканевой специфичностью [1250].
В заключение следует остановиться на некоторых методах обнаружения ядерных белков на электрофореграммах. Рэй и Стабблфилд [1449] окрашивали гистоны амидовым черным и обесцвечивали гели в 1 М серной кислоте, содержавшей 3 М мочевину. Высокая чувствительность этого метода, позволяющего обнаружить менее 0,1 мкг белка, обусловлена, вероятно, тем, что под действием серной кислоты не связанный с белком краситель превращается в лейкоформу.
Холмберг и Хуттунен [576] добились быстрого окрашивания гистонов путем электрофореза амидового черного в направлении, противоположном миграции гистонов. Баррет и Джонс [90] окрашивали гистоны 0,01%-ным бромфеноловым синим (pH3,0) в течение 16 ч, а затем обесцвечивали их в 40%-ном «-пропаноле 48 ч при 55°С (пропанол меняли пять раз). Окрашенными оставались только гистоны, богатые аргинином. Метод позволяет быстро отличать обогащенные аргинином гистоны от других типов этих белков.
П.7.2. Рибосомные белки
Синтез белков в живых клетках протекает при активном участии рибосом, которые с химической точки зрения представляют собой рибонуклеопротеиды. Каждая рибосома состоит из двух субчастиц. Более крупная субчастица содержит две молекулы рибонуклеиновой кислоты с разными молекулярными массами, а более мелкая — только одну молекулу рибонуклеиновой кислоты, отличную по молекулярной массе от двух указанных. С молекулами нуклеиновой кислоты в каждой субча-стице связано большое число белков. Что касается их состава, то рибосомы, выделенные из разных организмов, имеют ряд общих черт, однако существуют и значительные различия. Многие из них были обнаружены с помощью электрофореза.
Рибосомные белки очень сходны между собой по физико-химическим свойствам. Большинство их составляют основные
белки с относительно небольшими молекулярными массами (ме^ нее 100 000). В изолированном виде рибосомные белки не обладают никакой каталитической активностью и плохо растворяются в воде, поэтому многие классические методы разделения белков оказались малопригодными в случае рибосомных белков, и наиболее важное значение приобрели ионообменная хроматография и различные методы электрофореза.
Перед проведением электрофореза рибосомные белки необходимо экстрагировать из рибосом, рибосомных субчастиц или каких-либо других рибонуклеопротеидных частиц, полученных из рибосом. Чаще всего для этой цели применяют экстракцию уксусной кислотой [1370], смесью хлористого лития и мочевины [1220] или хлористым гуанидином [252], а также самопроизвольное (в присутствии мочевины) [1215] или ферментативное [1299] расщепление рибосомной РНК. Каждая из перечисленных процедур описана в нескольких вариантах, слегка различающихся между собой по концентрации компонентов экстрагирующих смесей.
