Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Впервые двухмерная система для электрофореза рибосомных белков была описана Кальтшмидтом и Уитменом [654]. Позднее сходные процедуры были применены и другими авторами. Все существующие в настоящее время методы можно разделить на две группы. К первой группе относятся методы, в которых при электрофорезе во втором направлении изменяют заряд белков, сдвигая pH буфера геля в ту или другую сторону. В методах второй группы заряд и структура белков, разделенных в первом направлении, резко изменяются в результате комплексообразования с ДСН.
В исходном методе Кальтшмидта и Уитмена [654] разделение рибосомных белков в первом направлении проводили при pH 9,6 или 8,6 в стеклянных трубках длиной 180 мм и диаметром 5 мм. Образец белка (1—4 мг) помещали в середину трубки, включая его в слой геля, образующегося путем фотополимеризации. В этих условиях одни рибосомные белки мигрировали к катоду, а другие — к аноду. Использованный на первом этапе 8%-ный полиакриламидный гель не обладал сколько-нибудь заметным свойством молекулярного сита. По окончании электрофореза примерно через 36 ч гели извлекали из стеклянных трубок и вымачивали в ацетатном буфере для стартового геля,, применяемом при электрофорезе во втором направлении. Этот
буфер меняли дважды в течение 3 ч. Электрофорез во втором направлении осуществляли на пластине геля (размером 200Х Х200 мм), содержавшего 18% акриламида и ацетатный буфер (pH 4,6). Во все буферные растворы добавляли мочевину в конечной концентрации 6 М. Недавно этот метод был детально рассмотрен Уитменом [1438]. С незначительными модификациями описанные буферные системы были использованы и для разделения рибосомных белков эукариот [641, 1179, 1398— 1400].
Было изучено влияние pH буфера первого направления на разделение белков в двухмерной системе [1180]. С этой целью были испытаны буферные растворы с pH 7,6, 8,6, 9,6 и 10,6; в «стандартных условиях» авторы использовали буфер с pH 8,6. Они показали, что исключение мочевины из электродного буфера первого направления не оказывает заметного воздействия на разделение.
Ховард и Троут [585, 586] описали микросистему для двухмерного электрофореза рибосомных белков. В первом направлении они использовали трубки длиной 120 мм, а во втором — пластинки размером 150X130 мм. Такая методика позволяла разделять около 0,1 мг рибосомных белков.
Очень важным этапом в методах двухмерного электрофореза является вымачивание гелей в буфере, применяемом для диализа, перед разделением белков во втором направлении. При длительном вымачивании, необходимом для изменения pH геля, могут происходить потери белка. Для устранения этой опасности Эвитал и Элсон [68] предложили другие способы под-кисления гелей после электрофореза в первом направлении. По предложенной ими методике разделение в первом направлении проводят так же, как в исходном методе Кальтшмидта и Уитмена [654], а затем гели либо погружают на несколько минут в охлажденную 0,3 н. НС1, либо помещают в закрытую камеру, заполненную парами хлористого водорода. Для установления необходимого времени инкубации можно использовать «контрольные» гели, содержащие соответствующий кислотно-щелочной индикатор.
Во второй группе методов двухмерного электрофореза разделение рибосомных белков проводят в буферной системе, аналогичной системе Рейсфелда и др. [1072]. Далее гели помещают в раствор, содержащий ДСН, меркаптоэтанол, фосфатный буфер и 5—6 М мочевину, и инкубируют не менее 30 мин при •осторожном покачивании. Затем проводят электрофорез во втором направлении на пластине геля, содержащего ДСН. Концентрация акриламида в этом геле обычно выше, чем в геле первого направления. Описано несколько вариантов метода, основанного на таком принципе [506, .596, 827, 943].
При двухмерном разделении рибосомных белков экстремально галофильной Halobacterium cutirubrum в первом направлении использовали щелочную систему (pH 9,8), а во втором направлении электрофорез проводили в присутствии ДСН [1241]. Рибосомные белки Chlamydomotias reinhardii были разделены с помощью двухмерного электрофореза в новой буферной системе [865, 866, 1245]. Электрофорез в первом направлении проводили в 48%-ном полиакриламидном геле, содержавшем 8 М мочевину и 0,057 М бис-трис, доведенный уксусной кислотой до pH 5,0. Такой буфер обеспечивал высокую буферную емкость при электрофорезе в первом направлении и одновременно играл роль концентрирующего буфера в неоднородной системе, использованной на втором этапе электрофореза. При электрофорезе в первом направлении верхним электродным буфером служил 0,01 М бис-трис, доведенный уксусной кислотой до pH 4,0, а нижним — 0,179 М ацетат калия, доведенный уксусной кислотой до 5,0. На гель наносили примерно 0,1—0,2 мг рибосомных белков. В качестве маркерного красителя добавляли основной фуксин. Пластина геля, используемого во втором направлении, содержала 10% акриламида и 0,143 М буфер бис-трис-НС1 (pH 6,75). Верхний электродный буфер состоял из 0,07 М морфолинэтансульфоната (МЭС), 0,07 М бис-трис, 3,5 мМ ДСН и тиогликолевой кислоты (для уменьшения возможного неблагоприятного влияния персульфата). Нижним буфером служил 0,028 М бис-трис-НС1 (pH 6,75). Во время электрофореза ДСН проникал в цилиндрически» гель и образовывал комплексы с белками, разделенными при первом электрофорезе. В процессе перемещения зон по направлению к пластине геля ДСН-белковые комплексы концентрировались между ведущими ионами ацетата и замыкающими ионами МЭС. Поэтому перед вторым этапом электрофореза не обязательно проводить вымачивание гелей в буфере с ДСН.
