Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Для локализации декарбоксилаз аминокислот применяют также моноаминоксидазы [45].
Описан аутохромный метод обнаружения карбоангидразы, основанный на изменении окраски бромтимолового синего в зоне локализации ферментативной активности [333]. Гели погружают в 0,1 М ацетат-вероналовый буфер (pH 8,1), к которому добавляют небольшое количество индикатора, растворенного в 50%-ном этаноле. Затем гели переносят в охлажденную воду, насыщенную СОг. Желтая полоса указывает место выделения протона. Однако этот метод не позволяет получать устойчивые энзимограммы. Предложен другой метод, основанный на флуоресценции бромкрезолового пурпурного [978]. Электрофорез' проводят в вогнутом градиенте полиакриламидного геля (4— 24%). Затем пластинки выдерживают в течение 1 мин при 0 °С в 1%-ном растворе бромкрезолового пурпурного в буфере, который применяется для электрофореза и имеет следующий состав: 10,75 г/л трис, 0,93 г/л ЭДТА, 5,04 г/л борной кислоты, 10 мМ дитиотреитол (pH 8,28 при 20 °С). С поверхности геля фильтровальной бумагой удаляют избыток жидкости и накрывают его
на 0,5—2 мин (необходимое время устанавливается в предварительных опытах) перевернутой воронкой, через которую пропускают струю чистого газообразного СОг. Сразу же по окончании этой процедуры гели замораживают в сухом льду и в замороженном состоянии просматривают в УФ-свете при длине волны 366 нм. Положение фермента определяют по ярко-желтой флуоресценции на розовом фоне.
Виднер и др. [1414] описали специальный прибор для непрерывного измерения проводимости в геле во время его вертикального перемещения сверху вниз в охлажденной (1°С) воде, насыщенной СОг. Как только анализируемый участок непрерывно движущегося геля касался раствора, с помощью полукруглых платиновых электродов измеряли его проводимость по диаметру стержня геля. Повышение проводимости, регистрируемое как функция расстояния данного участка от начала геля, указывало место ферментативного образования ионов водорода. Таким образом, этот метод можно использовать для обнаружения любого фермента, катализирующего образование или удаление протонов, например эстераз.
11.7. Электрофоретическое разделение некоторых групп белков
11.7.1, Ядерные белки
Предполагается, что ядерные белки играют определенную роль в регуляции экспрессии генов и в поддержании структуры хроматина, а некоторые из них являются ферментами, участвующими в синтезе нуклеиновых кислот. По химическим свойствам ядерные белки подразделяются на две группы; основные и кислые. Выделяют ядерные белки либо из интактных очищенных ядер, либо из хроматина путем кислотной экстракции. При этом основные белки растворяются, а кислые остаются в осадке, и их обычно переводят в раствор с помощью ДСН. Методы выделения и фракционирования ядерных белков описаны в ряде прекрасных обзоров [148, 187, 770] и специальных статей [118, 147, 482, 635, 1002, 1285].
Основные белки хроматина, гистоны, растворимы в кислой среде и легко образуют агрегаты, поэтому для исследования этих белков были разработаны специальные методы, например методы с применением электрофореза в свободной среде [290] или на бумаге [572]. Однако наилучшие результаты были получены при электрофорезе в крахмальном геле [638, 1248, 1249], на полосках ацетата целлюлозы [793] или в полиакриламидном геле.
При электрофорезе в крахмальном геле гистоны разделяют в 0,01 н. НС1 [638] или в системе лактат — мочевина [1248]. В последнем случае гель содержит 0,02 М лактат алюминия (pH 3,4) и 4 М мочевину. Электродные буферные растворы готовят из продажного препарата лактата алюминия, взятого в концентрации 0,02 М и доведенного молочной кислотой до pH 3,1.
Быстрого разделения гистонов можно достигнуть путем электрофореза на полосках ацетата целлюлозы в аммоний-бо-ратном буфере, pH 10 [793].
При электрофорезе гистонов в полиакриламидном геле используют как однородные, так и неоднородные системы. Джонс [636] применял в качестве буферной системы 0,01 М уксусную кислоту, а Паниим и Чолкли [962, 963] предложили следующую систему: 15,1% Т, 0,66% С, 2,5 М мочевина и 0,9 М уксусная кислота. Длина геля составляла 25 см. Гели перед нанесением
образцов подвергали преэлектрофорезу в электродном буфере (0,9 М уксусная кислота) в течение 1 ч. Образцы растворяли в 0,9 М уксусной кислоте, содержавшей 15% сахарозы, и наслаивали раствор на гель. Электрофорез проводили в течение-примерно 9 ч при силе тока 1,75 мА на одну трубку.
Для концентрирования белков были использованы ступенчатые градиенты проводимости [845] и pH [148, 1072, 1177].
Электрофорез по Боннеру и др. [148\. Разделяющий гель: 15,1% Т и 0,66% С или 7,7% Т и 2,6% С; 0,375 М ацетат калия (pH 4,3), 0,5%' ТЕМЭД, 0,125% персульфата аммония, 6,25 М. мочевина. Электродный буфер: 0,35 М р-аланин— 0,14 М уксусная кислота. Образцы растворяют в 10 М мочевине и наслаивают на гель.
Помимо указанных методов для разделения гистонов и определения их молекулярной массы широко применяют электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Следует» однако, иметь в виду, что при определении молекулярной массы гистонов методом электрофореза в полиакриламидном геле: иногда получают ошибочные результаты, если для построения: калибровочной кривой используют белки с усредненным аминокислотным составом. Этой опасности можно избежать, примем нив в качестве маркеров гистоны с известной молекулярной массой [964].
