Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Приложения тонкослойной гель-проникающей хроматографии
Если тонкослойная хроматография используется в первую очередь для аминокислот, сахаров, олигосахаров, липидов, стероидов и других небольших молекул, тонкослойная гель-хроматография применяется для белков, пептидов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и других гидрофильных веществ с высокой молекулярной массой.
Наибольшую ценность тонкослойная гель-проникающая хроматография представляет для определения молекулярной массы белков и пептидов. Для этого строят график, аналогичный показанному на рис. 8-19, где по оси у откладывают относительную подвижность. Метод позволяет получить весьма точные значения* особенно в тех случаях, когда проводится несколько определений.
Тонкослойная гель-проникающая хроматография находит применение в клинической диагностике для определения патологических белков в сыворотке крови, спинномозговой жидкости и моче. Конечно, метод используется и для проверки чистоты белков, ферментов и т. д. На основе этого метода разработаны такие модификации, как иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и изо-электрическая фокусировка.
По использованию тонкослойной гель-проникающей хроматографии имеется сравнительно мало литературы, однако этот метод находит все более широкое применение.
Ионообменная хроматография
Ионообменник представляет собой твердый носитель, химически соединенный с заряженными группами, способными связывать ионы за счет электростатического взаимодействия. Он способен обменивать эти ионы на ионы, содержащиеся в водном растворе. Иопообменники используются в колоночной хроматографии для разделения молекул в соответствии с их зарядом.
Принцип ионообменной хроматографии состоит в том, что заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником, так что молекулы могут связываться и элюироваться в зависимости от ионного состава среды. Разделение на понообмеиниках обычно проводится в две стадии: сперва соединение, которое требуется отделять, связывается с ионообменником в условиях образования стабильной связи, затем колонку промывают буфером с другим значением pH или с другой ионной силой, в результате чего компоненты буфера конкурируют со связанным веществом за связывающий центр.
Свойства ионообменников
Иопообменники обычно представляют собой трехмерную структуру (матрицу), содержащую ковалентно связанные с ней заряженные группы. Если группы заряжены отрицательно, они будут обменивать положительные ионы; в этом случае они служат катионообменниками, или катионитами. Типичными группами в катионитах являются сульфогруппы S03“. Если с такой группой связан ион Н+, говорят, что катионит находится в кислой форме. Он может, например, обменять один Н+ на один Na+ или два Н+ на один Са+2. Ионообменные смолы, содержащие сульфогруппы, называют сильными катионообменниками. Другими широко распространенными сорбентами этого типа являются смолы, содержащие фенольную гидроксильную или карбоксильную группы,
представляющие собой слабые катионообменники. Если заряд группы положителен, например четвертичная аминогруппа, она является сильноосновиым анионообменником. В качестве слабоосновных анионообменников используют ароматические или алифатические аминогруппы.
Матрицу можно изготовить из различных материалов. Чаще всего применяются декстран, целлюлоза и сополимер стирола и дивинилбензола, причем дивинилбензол сшивает цепи полистирола. В табл. 8-3 даны составы многих распространенных ионо-обменников.
ТАБЛИЦА 8-3
Свойства различных ионообменников
Матрица Тип Функциональные группы Фирменнве название
обмен
ника®
Декстран ск Сульфопропильные SP-Sephadex (СП-сефа-
декс)
Сл К Карбоксиметильные CM-Sephadex (КМ-сефа-
декс)
СА Диэтил-(2-оксипропил)- QAE-Sephadex (КАЭ-се-
аминоэтильные фадекс)
СлА Диэтиламиноэтильные DEAE-sephadex (ДЭАЭ-
сефадекс)
Целлюлоза К Карбоксиметильные CM-cellulosa (КМ-цел-
люлоза)
К Фосфатные Р-cel (фосфоцеллюлоза)
А Диэтиламиноэтильные DEAE-celluIosa (ДЭАЭ-
целлюлоза)
А Полиэтилениминные PEI-cellulosa (ПЭИ-цел-
люлоза)
А Бензоилированные наф- DEAE (BND)-cellulosa
тоилированные, диэ [ДЭАЭ(БНД)-цел
тиламиноэтильные люлоза]
