Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Определение распределения по молекулярным массам часто дает ценную характеристику природных и синтетических полимеров. Напомним, что использование для этой цели физических методов, таких, как центрифугирование, требует относительно чистого материала. Применение же гель-проникающей хроматографии позволяет определить распределение простым измерением количества вещества как функции элюируемого объема. Для этого строят калибровочную прямую и проводят простую математическую коррекцию уширения зон.
Приложения гель-проникающей хроматографии
Гель-проникающая хроматография в основном служит для разделения и находит широкое применение для очистки белков, в частности ферментов, а также нуклеиновых кислот. Гели па основе декстрана особенно ценны при работе с нестабильными белками, что уже отмечалось выше. В препаративных целях используются как декстраны, так и полиакриламиды, причем объем геля может варьировать от нескольких миллилитров до нескольких литров. В промышленности находят применение колонки объемом 1000 л. Использование геля агарозы дает возможность с успехом фракционировать и очищать различные виды РНК и вирусов.
При очистке больших количеств макромолекул, где требуются различные виды фракционирования, часто бывает необходимо удалить соли, сменить буфер, сконцентрировать вещество, удалить вещества типа фенола и детергенты, используемые при выделении и очистке нуклеиновых кислот. Эти процедуры часто занимают много времени (например, осаждение или диализ) и поэтому могут приводить к потерям нестабильных веществ. Гель-проникающая хроматография позволяет быстро решить эти задачи. Например, соли и небольшие молекулы легко могут быть удалены, поскольку они задерживаются всеми гелями.
Смена буфера достигается простым пропусканием раствора макромолекул через колонку, предварительно уравновешенную другим буфером. Поскольку макромолекулы движутся через гель с большей легкостью, чем компоненты исходного буфера, они будут элюироваться буфером, которым была уравновешена колонка. Концентрирование макромолекул легко осуществляется простым добавлением к раствору сухих гранул геля, имеющего размер пор меньший, чем размер присутствующих макромолекул. При набухании гранул происходит поглощение воды, но не макромолекул, которые при этом концентрируются. Большинство процедур концентрирования макромолекул связано с одновременным увеличением концентрации присутствующих солей, что может вызвать изменения макромолекул (иногда диссоциацию или денатурацию). При использовании геля этой проблемы не существует, так как гель поглощает в равной степени и воду и соли.
Приведем ряд конкретных примеров использования гель-проникающей хроматографии в препаративных целях (т. е. для очистки и анализа):
1. В химических синтезах различных соединений обычно существует необходимость отделения продукта от реагентов. Например, при получении флуоресцентных антител (гл. 2 и 10) в результате реакции антитела с изотиоцианатом флуоресцеина
конъюгированный белок требуется отделить от непрореагировавшего красителя. Это можно сделать при помощи сефадекса, используя гель, в котором крупные молекулы белка выходят с холостым объемом. Естественно, что непрореагировавший белок не будет при этом отделяться от конъюгированного, однако для методов работы с флуоресцентными антителами это не обязательно.
2. При анализе ферментов или при определении требующихся кофакторов ферментные препараты иногда содержат ингибиторы с низкой молекулярной массой или собственно кофакторы. При изучении некоторых молекул физическими методами (например, флуоресцентной спектроскопией) в образце могут присутствовать вещества, искажающие результаты. Такие небольшие молекулы можно легко удалить на геле декстрана или полиакриламида.
3. Иногда подлежащие исследованию небольшие молекулы биополимера имеют в качестве примеси макромолекулы. В этих случаях оказываются полезными декстраны с малыми размерами пор. Так, белки часто требуется освободить от содержащихся примесей нуклеиновых кислот; это иногда осуществляется с использованием геля агарозы, который задерживает все белки, тогда как нуклеиновые кислоты выходят с холостым объемом.
4. Для большинства физических исследований нуклеиновых кислот образец не должен содержать белка. Этого легко достичь. Интересный образец из моей собственной лаборатории был получен из экстракта клеток: содержащуюся в нем ДНК изучали методом электронной микроскопии с использованием цитохромо-вого метода Кляйншмидта (гл. 3). Маленькие порции (20— 50 мкл) экстракта клеток, содержащего ДНК, пропускали через крошечные колонки с сефарозой, предварительно уравновешенные раствором, служащим для электронной микроскопии. ДНК выходила с колонок с холостым объемом в требуемом буфере, тогда как весь остальной материал задерживался. Последующее добавление цитохрома с давало образец, готовый к исследованию методом микроскопии.
5. Одним из наиболее распространенных приложений гель-проникающей хроматографии является очистка белков (см. «Приложение», стадия 7). Для очистки белка из экстракта клеток обычно бывает необходимо использовать последовательность операций, основанных на таких свойствах белка, как растворимость в некоторых растворах, величина заряда молекул, молекулярная масса и т. д. На стадии, где разделение проводится по размерам молекул, практически всегда используется гель-прони-кающая хроматография.
