Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
"пГ
ООО о
ООО О.® QO
® ® о
оо оо
О частица геля
• молекулы, меньшие, чем поры геля
• молекулы* большие , чем поры геля
РИС. 8-18.
Разделение двух типов молекул прп прохождении через колонку, содержащую частицы пористого геля. Молекулы, размеры которых больше пор, двигаются быстрее тех молекул, размеры которых меньше, поскольку последние входят в поры и выходят из них.
рез колонку. Следовательно, молекулы элюируются с такой колонки в порядке уменьшения их размера или, если форма их относительно сходна (например, глобулярная или линейная), в порядке уменьшения молекулярной массы.
При более подробном анализе механизма гель-проникающей хроматографии становится ясно, что такой стерический эффект, хотя и играет существенную роль, тем не менее не может дать объяснения хроматографического поведения всех молекул. Другой важной причиной является заряд молекул. Известно, что при очень низкой ионной силе маленькие молекулы с высоким зарядом не входят в поры даже тогда, когда их размеры это позволяют. Это явление, вероятно, можно объяснить влиянием электростатического отталкивания между молекулами, что ограничивает число молекул в каждой поре. При очень низкой ионной силе для некоторых типов геля характерно также проявление явных адсорбционных эффектов.
Материалы
для гель-проникающей хроматографии
Гель представляет собой трехмерную сетку, обычно со статистически расположенными узлами. Гели, используемые в качестве молекулярных сит, — это сшитые полимеры, которые в общем инертны, не связываются и не реагируют с анализируемыми веществами и не имеют заряда. Пространство внутри геля заполне-
но жидкостью, причем эта жидкость занимает большую часть объема геля.
Обычно применяются гели на основе декстрана, агарозы и полиакриламида. Все они используются для водных растворов.
Декстран представляет собой полисхарид, построенный из остатков глюкозы, получаемый при выращивании микроорганизма Leuconostoc mesenteroides на сахарозе. Степень сшивания декстрана может быть различной, что позволяет получать материал с различным размером пор. Выпускается он в виде сухих гранул нескольких стандартных размеров, которые набухают при добавлении воды. При набухании поры заполняются жидкостью, которая используется в качестве элюента. Такой материал известен под названием «сефадекс» (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.).
Агароза получается из некоторых морских водорослей и представляет собой линейный полимер из чередующихся остатков о-галактозы и 3,6-ангидро-ь -галактозы. Характерной особенностью агарозы служит способность образовывать прочный гель, который стабилизирован водородными связями без поперечных связей. Агароза растворяется в кипящей воде и образует гель при охлаждении. Концентрация полисахарида в геле определяет размер пор, которые больше, чем в сефадексе. Гель агарозы полезен при анализе или разделении высокомолекулярных глобулярных белков или длинных линейных молекул, таких, как ДНК. Агарозу почти не используют в виде сплошного геля, так как скорость тока жидкости через него крайне низка; поэтому ее, как правило, выпускают в виде влажных гранул под названием «се-фароза» (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) и биогель A (Bio-Rad Laboratories).
Полиакриламидные гели получают при сшивании молекул акриламида с N, N'-метилен-биг-акриламидом. Здесь размер пор также определяется степенью сшивания. Эти гели отличаются от гелей декстрана и агарозы числом полярных карбоксиамидных групп на некоторых атомах углерода, однако их разделительные свойства очень схожи с гелем декстрана. Полиакриламидные гели, известные как биогель Р (Bio-Rad Laboratories), применяются для тех же целей, что и декстран, хотя и несколько реже. Преимущество их перед декстранами состоит в возможности получить более широкий спектр размеров пор.
Недавно для водных растворов начали использовать стеклянные шарики с пористой поверхностью (биоглас, Bio-Rad Laboratories), однако данные по их применению пока еще слишком ограниченны.
Описанные выше гели набухают в воде и некоторых органических растворителях: этиленгликоле, формамиде и диметилсуль-фоксиде. Однако набухания не происходит в чистых спиртах, углеводородах и большинстве полярных и неполярных органиче-
ских растворителей. Известно, что такие вещества, как липиды, стероиды и некоторые витамины, легче растворяются именно в таких растворителях. Для работы в этих условиях разработаны специальные гели. Для гель-проиикающей хроматографии в неполярных органических растворителях хорошо подходит сшитый полистирол (стирагель, Dow Chemical Со; биобедс S, Bio-Rad Laboratories). При использовании полярных органических растворителей хорошим материалом служит метилированный сефа-декс. Оксипропильное производное сшитого декстрана (сефа-декс LH) можно применять для работы как в полярных, так и неполярных растворителях.
ТАБЛИЦА 8-2
Носители, используемые в гель-проникающей хроматографии
Исходный продукт II Молекулярная масса
