Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
рис, 8-10. Если замена аминокислоты не влияет на место разрыва связи протеиназой, на пептидной карте будет исчезать одно пятно, вместо которого будет появляться другое. Если замена приводит к изменению места разрыва связи, изменят свое положение сразу несколько пятен. Элюирование пятен с пептидной карты первоначального и мутантного белков и определение аминокислотной последовательности каждого из них (это можно осуще* ствить с помощью полного ферментативного гидролиза до аминокислот с последующей хроматографией на бумаге) позволяют установить замененные аминокислоты.
Метод пептидных карт находит несколько важных приложений в молекулярной биологии, из которых следует отметить следующие:
Доказательство того, что белок А является продуктом расщепления большего белка Б. Если на пептидной карте белка А имеются все те же пятна, что и на пептидной карте белка Б, весьма вероятно, что белок А является частью аминокислотной последовательности белка Б. Следовательно, либо белок Б происходит из белка А путем добавления аминокислот, либо белок А получается
из белка Б при гидролизе. Как правило, изучение кинетики синтеза белков А и Б позволяет сделать выбор между этими возможностями.
Идентификация аминокислот, вводимых с помощью различных супрессорных транспортных РНК. Некоторые мутации приводят к преждевременному обрыву цепи аминокислотной последовательности в белках. Это терминирование может быть предотвращено в присутствии молекул супрессорной тРНК, которая вводит аминокислоту по месту преждевременного обрыва цепи и тем самым позволяет продолжить синтез до естественного окончания. В получающемся при этом белке заменена лишь одна аминокислота. Пептидные карты таких белков дают возможность идентифицировать аминокислоту, вводимую каждой из известных супрессорных тРНК.
Идентификация замен оснований в результате частичного мутагенеза. Так как генетический код хорошо известен, можно идентифицировать замены оснований при частичных мутациях. Предположим, например, что мутаген способен приводить к частой замене фенилаланина на изолейцин. Триплетные кодоны ДНК, соответствующие фенилаланину, представляют собой последовательности ААА и AAG, а для изолейцина — ТАА, TAG и ТАТ. Поскольку большинство мутаций приводит к замене только одного основания, данный мутаген будет вызывать частое замещение А на Т.
Тонкослойная хроматография
Тонкослойная хроматография (ТСХ) первоначально была разработана для разделения липидов. Хотя хроматография на бумаге быстрее, чем хроматография на колонке, к недостаткам ее следует отнести то, что бумага может быть изготовлена только из материалов на основе целлюлозы, что не позволяет применять ее для разделения неполярных веществ. Тонкослойная хроматография сохраняет все преимущества хроматографии на бумаге, но при этом позволяет использовать любой материал, который можно тонко измельчить и получить затем однородный слой. Это могут быть неорганические вещества, например силикагель, окись алюминия, диатомовая земля и силикат магния, а также органические вещества, в частности целлюлоза, полиамиды и порошок полиэтилена.
В тонкослойной хроматографии неподвижной фазой служит слой (0,25—0,5 мм) сорбента, равномерно нанесенного на поверхность стеклянной или пластмассовой пластинки. Хотя в настоящее время выпускаются готовые пластинки с различными сорбентами, все же приведем методику их приготовления.
_Z_
РИС 8-11.
Типичная камера для проявления хроматографической пластинки с тонким слоем.
1 — крышка; 2 —стеклянная камера; 3 —пластинка ТСХ;
2 * — сорбент; 5 — место нанесения пробы; 6 — раствори-
-4
5
6
Сначала получают суспензию сорбента в специфическом для него растворителе. Для очень маленьких хроматограмм предметное стекло микроскопа покрывают слоем сорбента, погружая его в суспензию. Для хроматограмм большего размера на стеклянную пластинку наносят несколько слоев узких лент по обоим краям таким образом, чтобы во время хроматографии они были вертикальными. Число слоев определяет толщину конечного слоя сорбента. Суспензию осторожно наливают на стекло, после чего выравнивают скользящим стеклянным стержнем, который захватывает при этом всю ширину пластинки. Затем пластинку высушивают и ленты удаляют. Пластинки обрабатывают так же, как при хроматографии на бумаге. Образец наносят микропипеткой и высушивают. Пластинку ТСХ помещают в камеру, содержащую растворитель, и проявляют восходящей хроматографией (рис. 8-11). После того как фронт растворителя почти достигнет верхнего края, пластинку вынимают из камеры и сушат. Для получения двумерной хроматограммы высушенную пластинку можно повторно хроматографировать под прямым углом в другом растворителе. Положение пятен, как и при хроматографии на бумаге, определяют по окраске, по флуоресценции или при опрыскивании различными реагентами, которые реагируют с веществами в пятне с образованием окрашенных продуктов. Обычно используют следующие реагенты: нингидрин для аминокислот, родамин В для липидов, хлорид сурьмы для стероидов и терпенов, серную кислоту с последующим нагреванием практически для всех органических соединений (происходит обугливание), перманганат калия в серной кислоте для углеводородов, анисовый альдегид в серной кислоте для углеводов, пары брома для оле-финов и т. д. Вещества можно элюировать путем соскребания
