Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Бумажные хроматограммы могут проявляться как в восходящем, так и в нисходящем токе растворителя. Устройства для каждого из этих вариантов изображены на рис.8-7. Получаемые при этом хроматограммы по качеству различаются лишь незначительно, поэтому выбор варианта, как правило, определяется личными приверженностями экспериментатора. Нисходящая хроматография имеет два преимущества:
1) она требует меньше времени, так как под действием силы тяжести ток растворителя ускоряется, и 2) количественное разде-
Н
х Е
<U О
оо О.
Ш
бумага
растворителя к моменту высушивания
РИС. 8-6.
Нанесение образца и проявление хроматограммы на бумаге в случае смеси из трех компонентов.
/ — нанесение пробы; 2 — этот конец погружается в растворитель; 3 — фронт растворителя начинает движение; 4—начало разделения; 5 —разделение продолжается; 6 — бумага высушивается.
1 ^ 2
8
5 РИС. 8-7.
Устройства для нисходящей и восходящей хроматографии.
А — нисходящая; Б — восходящая. 1 — крышка; 2 — растворитель; 3 — лодочка с растворителем; 4 — поддерживаю-д щий стержень; 5 — бумага; 6 — стеклянная камера; 7 — избыток растворителя для поддержания влажности; 8 — зажим для удерживания бумаги; 9 — А В проявляющий растворитель.
ление веществ с очень малыми значениями Rf, требующих больших пробегов, можно провести при помощи перетекания растворителя. Единственным недостатком является то, что хроматографическую камеру каждый раз необходимо подготавливать с ¦большой тщательностью, так как загрязнение или плохой контакт бумаги в месте соприкосновения со стенкой лодочки может приводить к неоднородному току и, как следствие, к образованию полос.
РИС. 8-8.
Двумерная хроматография на бумаге.
/ — направление движения первого рас» творителя; 2 — направление движения второго растворителя; 3 — разделение при применении только второго растворителя; 4 — разделение при последовательном применении обоих растворителей; 5 — разделение при применении только первого растворителя.
Нередко весьма эффективен вариант, известный как двумерная хроматография на бумаге. Метод заключается в том, что после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и затем повторно хроматографируют под прямым углом к направлению первоначального движения растворителя с использованием другого растворителя (рис. 8-8). При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе.
Обнаружение и идентификация пятен
Пятна на бумажных хроматограммах могут быть обнаружены по их цвету, флуоресценции, с помощью химических реакций, которые происходят после опрыскивания бумаги различными реагентами, или по радиоактивности (рис. 8-9). Авторадиографическое обнаружение пятен с использованием рентгеновской пленки описано в гл. 6. Идентификацию обычно проводят путем сравнения с заведомыми образцами с известными величинами Rf или после элюирования. Элюирование сводится к вырезанию из бумаги зоны, содержащей пятно, с последующим промыванием сс соответствующим растворителем; элюирование обычно протекает количественно.
Пептидные карты: специальное использование
бумажной хроматографии при изучении белков
Важной проблемой в молекулярной биологии является идентификация выделенного белка или установление изменения аминокислотного состава в мутантном белке. Техника «отпечатков
f
о о оо ооо
0 ° о
0 ° ® о
О о о
0 ° о
о О о
0 ° о
т
РИС. 8-9.
Хроматограмма четырех аминокислот на бумаге.
После высушивания бумагу опрыскивали нингидри-ном, который дает окрашенные продукты с аминокислотами. Точка показывает исходное положение пробы. Справа изображены контуры каждого пятна.
пальцев», разработанная Верноном Ингрэмом, позволяет довольно просто решить эти задачи.
Если белок подвергать расщеплению в стандартных условиях с использованием различных протеиназ (ферменты, разрывающие пептидные связи), в качестве продуктов образуются небольшие пептиды. Число и типы получающихся пептидов зависят от строения данного белка и вида использованной протеиназы (например, конкретная протеиназа может осуществлять разрыв пептидных связей только после определенной аминокислоты или класса аминокислот). Пептиды можно затем разделить с помощью двумерной хроматографии на бумаге, получая при этом распределение пятен, которое практически никогда не совпадает для различных белков. Такая пептидная карта называется «отпечатками пальцев» (рис. 8-10).
Пептидная карта мутантного белка, отличающегося от белка дикого типа только на одну аминокислоту, изображена на
НЬ A His-Val-leu-Leu-Thr-Pro- GZu-Glu-Lys Hb С His-VaVLeu-Leu-Thr-Pro-i^s-Glu-Lys
РИС* 8-10.
Пептидные карты продуктов расщепления трипсином двух различных гемоглобинов человека.
Полученные при этом пептиды вначале хроматографировали, а затем подвергали электрофорезу. Отметим, что помеченный в случае нормального гемоглобина А (НЬ А) пептид отсутствует для гемоглобина С (НЬ С), зато появляются два новых пептида, 4а и 4Ь. Последовательность аминокислот в пептидах 4, 4а и 4b при этом установлена. Превращение глутаминовой кислоты (Glu) в лизин (Lys) в измененном гемоглобине вызывает появление двух новых пептидов, поскольку трипсин не может разрывать связь м$жду двумя остатками глутаминовой кислоты, но способен разрывать пептидную связь между лизином и глутаминовой кислотой [Hunt J. A., Ingram V. М., Nature, 181, 1062—1063 (1958)].
