Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
коммерческое название разделяемых веществ3
Деке трен
Сефадекс G-10 7000
Сефадекс G-25 1000---босо
Сефадекс G-75 3000---70 000
Сефадекс G-200 5000---800 000
Полиакриламид
Биогель Р-2 200-2000
Биогель Р-6 1000---6000
Биогель Р-150 15 000---150 000
Биогель Р-ЗСО 60 000---400 000
Агс роза
Сефароза 2R 2 ¦ 106---25* 10б
Сефароза 4В 3-105---3- 10е
Биогель А-0,5 М 30 000---500 000
Биогель А-15 М 30 000---15-106
Биогель А-150 М 5- 10е---150- 10е
а Глобулярные белки или полинуклеотиды.
Пределы молекулярных масс, в которых происходит фракцио-
нирование, в первую очередь определяются размерами пор. В табл. 8-2 приведены соответствующие данные для наиболее употребительных материалов. Таким образом можно без труда выбрать требуемый гель. Однако гранулы геля могут быть следующих размеров: крупные, средние, тонкие и супертонкие. Есть
правило, согласно которому с увеличением размера гранул ускоряется ток элюента и ухудшается разрешение. Следовательно, су-пертонкие гранулы применяются в тех случаях, когда требуется максимальное разрешение, например для аналитических целей. Тонкие гранулы рекомендуются для препаративных задач, если колонка не слишком длинная, а скорость тока имеет не слишком большое значение. Более крупные гранулы применяются для разделений в больших масштабах, когда разрешение имеет меньшее значение, чем время разделения.
Достоинства гель-проникающей хроматографии
Гель-проникающая хроматография незаменима для разделения молекул, отличающихся по молекулярным массам, по следующим причинам:
1. Хроматографическое поведение практически всех веществ в геле не зависит от температуры, pH, ионной силы и состава буфера, разделение можно проводить почти в любых условиях. Для очень лабильных веществ (например, ферментов) это означает возможность соблюдения условий максимальной стабильности.
2. Так как адсорбция практически отсутствует, очень лабильные вещества не изменяются в результате хроматографии. Это очень существенно, так как некоторые ферменты инактивируются или изменяют свои свойства при связывании с адсорбирующей поверхностью или ионообменной смолой.
3. Уширение зон в гель-проникающей хроматографии меньшее, чем в других хроматографических методах (причины этого неизвестны) .
4. Объем элюирования находится в прямой зависимости от молекулярной массы.
Определение молекулярной массы
Для различных типов гелей установлено, что зависимость параметра К от \gM {М — молекулярная масса) представляет собой прямую линию для всех молекул, исключая очень большие и очень маленькие (рис. 8-19). Исключение могут составлять низкомолекулярные ароматические соединения, молекулы с большим зарядом при низкой ионной силе (<С0,01) и некоторые линейные молекулы, такие, как коллаген и фибриноген. Параметр К определяется как (Ve—Vo)/Vs, где Ve — объем растворителя, требуемый для элюирования интересующего соединения, Vo — нулевой или холостой объем, необходимый для элюирования соединения, которое не проникает в неподвижную фазу, и V& — объем неподвижной фазы. В гель-проникающей хроматографии V$ — объем геля (большую часть которого составляют поры), а величине Vo
РИС. 8-19.
Типичные результаты, полученные при определении приблизительной молекулярной массы белков с помощью гель-проникающей хроматографии, с использованием трех известных белков (черные кружки) и двух различных типов геля (гель 1 и гель 2). Квадратиками обозначен образец (определение К описано в тексте). Использование двух различных типов гелей бывает полезным, так как обычно, если поведение белка не отвечает зависимости К—Ig М (вследствие своей формы), измеренное значение М будет различным для двух гелей.
отвечает объем, необходимый для элюирования вещества, которое совершенно не проникает в поры; для определения Vo обычно через колонку пропускают вещество с исключительно высокой молекулярной массой — голубой декстран. Vs измеряют как разность между Vt и Vo, где V% — общий объем колонки.
Для глобулярных белков и многих углеводов эта методика дает очень надежные результаты при использовании различных типов сефадекса и биогеля Р. Очень важно, что величину М можно определить на нефракционированных экстрактах клеток при условии, что анализируемый белок известен; почти все другие методы требуют достаточно очищенных препаратов. Таким образом, для определения М достаточно пропустить через колонку несколько молекул с известной молекулярной массой, по полученным данным построить прямую линию, после чего М образца можно определить интерполяцией. Точность такого определения составляет около 10%. Некоторые более точные методики определения молекулярной массы будут обсуждаться в разделе, посвященном тонкослойной гель-проникающей хроматографии.
