Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Идентификация неизвестных веществ представляет большие трудности, причем здесь нет какого-либо общего метода. Иногда элюируемый газ пропускают через контрольный раствор, который дает специфическую окраску с различными функциональными группами (например, альдегидной, спиртовой и т. д.). Другой метод предусматривает химическую модификацию и повторное хроматографирование с различными стандартами или анализ с использованием других физических методов. Это часто делают в тех случаях, когда существуют некоторые предположения по поводу неизвестных веществ. Естественно, что при идентификации веществ всегда необходимо применять детектор, не вызывающий деструкции (например, катарометр).
Количественное определение веществ в пиках также не является стандартной процедурой. Для каждого вещества его количество пропорционально площади соответствующего пика. Однако константы пропорциональности для различных веществ не совпадают. Следовательно, первой задачей является надежная идентификация вещества, соответствующего данному пику. Далее для количественного определения следует построить калибровочный график, для чего хроматографируют различные количества данного вещества и устанавливают зависимость между относительной площадью пика и количеством вещества.
Достоинства газожидкостной хроматографии
Газожидкостная хроматография обладает высокой разрешающей способностью. При этом метод чрезвычайно чувствителен и требует мало времени. Достаточно сказать, что многие вещества можно определять в количестве 10“12 г. Поскольку скорость проявления хроматограмм зависит от скорости диффузии между подвижной и неподвижной фазами, а скорость диффузии газов много больше, чем скорость диффузии жидкостей, скорость разделения в газовой хроматографии примерно в тысячу раз больше, чем в жидкостной. Таким образом, на разделение зачастую требуется менее минуты. Более того, газожидкостную хроматографию можно использовать в препаративных целях, если применять детекторы, не вызывающие деструкции веществ, и конденсировать вещества на выходе из колонки. Большие препаративные хроматографы позволяют получать высокоочищенные вещества в количестве граммов.
Применение газожидкостной хроматографии
Газожидкостную хроматографию можно применять для любых веществ, способных испаряться (сюда относятся тысячи органических соединений). Нелетучие вещества также могут быть про-
анализированы после превращения их в летучие производные путем окисления, ацилирования, алкирования и т. д.
В биологических образцах чаще всего требуется разделение спиртов, сложных эфиров, жирных кислот и аминов. Это особенно важно при изучении промежуточных стадий метаболизма и исследовании механизмов ферментативных реакций. Метод широко применяется для идентификации компонентов душистых веществ и вин и для обнаружения пестицидов в биологическом материале.
Газожидкостная хроматография также играет важную роль в органическом анализе. В частности, углерод и водород можно определять с точностью 0,5 и 0,1% соответственно, сжигая образцы в токе сухого кислорода, не содержащего примесей СО2 и Н20, и определяя количества СОо и Н20. Можно также определять и функциональные группы. Например, алкоксигруппы определяют путем иодирования с образованием йодистого алкила, который затем легко идентифицировать. Положение двойной связи легко определить с помощью расщепления связи озонолизом или окислением с последующей хроматографией продуктов.
Г ель-проникающая хроматография
Г'ель-проиикающая хроматография (ее иногда называют молекулярно-ситовой хроматографией) представляет собой особый вид распределительной хроматографии, где разделение основано на размерах молекул разделяемых веществ.
Теоретические основы гель-проникающей хроматографии
Основа гель-проникающей хроматографии достаточно, проста. Колонка изготавливается из мелких частиц инертного материала, который содержит маленькие поры. Если раствор, содержащий молекулы различной величины, пропускать через такую колонку (рис. 8-18), молекулы, размер которых превышает размер пор, будут двигаться только в пространстве между частицами и поэтому не будут задерживаться материалом колонки. Однако молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в частицы и обратно, причем вероятность этого повышается с уменьшением их размера, т. е. движение молекул по колонке замедляется. Если материал частиц в колонке (гель) не адсорбирует молекул, вероятность проникновения молекул в поры является основным фактором, определяющим скорость движения че-
слои образца"4»
WiWi*
оооо
ООО
оооо
ООО
ОООО
ООО
12°р
а®„®®
сгайго
ООО
ОООО
ООО
рооо,у
