Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Три общих типа распределения растворенного вещества между адсорбентом и растворителем как функция концентрации раст* воренного вещества.
Эти кривые называются изотермами адсорбции. Поскольку количество связываемого вещества зависит от концентрации, распределение как функция числа переносов более сложно, чем на рис. 8-1.
ния характеристична для конкретной молекулы и сорбента. Если раствор с данной концентрацией молекул нанести на поверхность (которая обычно представляет собой множество частиц в колонке или па твердой подложке) и растворитель пропускать в направлении, перпендикулярном поверхности, определенное число молекул будет удерживаться, а остальные будут двигаться вместе с растворителем. Продвигающееся вещество будет связываться, причем необходимо учитывать два следующих параметра:
1) удерживающей силой является связывание или адсорбция и
2) количество связанного вещества не постоянно, а уменьшается с уменьшением концентрации. Скорость движения вещества зависит от прочности связывания, т. е. чем прочнее связывание, тем медленнее движется вещество. Отсюда понятно, что молекулы можно разделить в том случае, когда для них характерны неодинаковые изотермы адсорбции, поскольку в этом случае они будут связываться в различной степени.
Виды адсорбционной хроматографии
В адсорбционной хроматографии используется подвижная жидкая фаза и твердая неподвижная, за исключением газожидкостной хроматографии (см. разд. «Газожидкостная хроматография»). Разделение проводят либо на колонках, либо в тонком слое. В табл. 8-1 приведены наиболее распространенные адсорбенты и области их применения.
ТАБЛИЦА 8-1
Носители, наиболее часто используемые для адсорбционной хроматографии
Носитель Разделяемые вещества
Окись алюминия Низкомолекулярные органические сое
динения, белки
Силикагель Стерины, аминокислоты
Активированный уголь Пептиды, аминокислоты, углеводы
Кальцийфосфатный гель Белки, полинуклеотиды
Гидроксиапатит Нуклеиновые кислоты
Концентрация раствора
Важным вариантом адсорбционной хроматографии является ионообменная хроматография (см. разд. «Ионообменная хроматография»). Основное его отличие заключается в том, что состав подвижной фазы выбирается так, чтобы при используемом адсорбенте растворенное вещество становилось иммобилизованным. При этом вещество остается неподвижным до тех пор, пока не будет добавлена новая подвижная фаза. В принципе здесь нет особых отличий, однако адсорбция в этом случае исключительно сильна.
Важно усвоить, что распределительная и адсорбционная хроматография не имеют обычно четких границ; так, явления адсорбции могут иметь место при хроматографии на бумаге, тонкослойной и гель-проникающей хроматографии.
Работа колонки
Вероятно, наиболее распространенным способом формирования неподвижной фазы служит использование колонок. В колоночной хроматографии колонка заполняется неподвижной фазой и раст-
РИС. 8-3.
Работа с колонкой, включая введение вещества и различные стадии элюирования.
образец вводится тонким слоем на коленку: 2— образец проникает в насадку; 3— добавляется растворитель; 4 — разделение начинается; 5 — элюируется первый компонент; 6 — элюирование продолжается; 7 — элюируется второй компонент.
ворителем. Затем небольшой объем (т. е. тонкий слой) образца наносится на неподвижную фазу таким образом, чтобы он про* ник в верхний слой (это называется загрузкой колонки). Хроматограмма проявляется при протекании через колонку растворителя ( подвижной фазы), как показано на рис. 8-3. Этот процесс называется элюированием колонки. При движении различных веществ через колонку они разделяются и при пропускании через колонку определенных количеств растворителя появляются в элюате. Общий объем твердой и жидкой фаз в колонке называется мертвым объемом (объемом насадки). Объем подвижной фазы носит название холостого или удерживаемого объема. Количество жидкости, необходимое для образования пика конкретного вещества в элюате, называется объемом элюирования.
Способ, которым в колонке формируется насадка,, называется упаковкой (набивкой). Важно, чтобы насадка была гомогенной и свободной от пузырей, трещин или незаполненных пространств, особенно вблизи стенок. Процесс нарушения потока, являющийся результатом недостаточной гомогенности, носит название образования каналов. Обычно в результате образования каналов искажается профиль элюирования, при котором индивидуальные вещества выходят в виде нескольких пиков. Это происходит из-за быстропо движения подвижной фазы через колонку, вследствие чего наблюдается перенос распределения или адсорбции в новую точку.
Выходящая из колонки жидкость (элюат) обычно собирается в виде отдельных фракций при помощи автоматического коллектора фракций, как показано на рис. 8-4. Разделенные компоненты затем определяются в аликвотах, отбираемых из каждой фракции, с помощью спектральных измерений, химических тестов, измерения радиоактивности и т. д. Для измерения поглощения света применяют автоматический самопишущий спектрофотометр' непрерывного действия. Прежде чем вещество попадет в коллектор, элюат проходит через кювету, в которой постоянно измеряется оптическая плотность при соответствующей длине волны; результаты измерения регистрируются самописцем.
