Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 72

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 218 >> Следующая

Гель-проникающая хроматография с успехом применяется и в аналитических целях. Определение молекулярной массы, как наиболее важная операция, уже упоминалось выше. Приведем несколько других примеров:
50 100 150 200
0<5гел1 элюирования, мл
РИС. 8-20.
Разделение различных образцов нуклеиновых кислот с помощью хроматографии на сефарозе.
Клетки КБ были инфицированы полиовирусом, меченным 32Р. Вскоре после заражения клетки подвергали лизису, нуклеиновые кислоты выделяли и хроматографировали. Общее количество клеточных нуклешговых кислот определяли путем измерения оптической плотности при 26и нм. Полио-РНК обнаруживали по ее радиоактивности. Пики слева направо соответствуют ДНК. клеток КВ, иолио-РПК, рибосомальной РНК КВ и транспортной РНК КВ. (Любезно предоставлено Pharmacia Fine Chemicals, Inc.)
-10"
10 1ч 18
Номер фракции
Нпмер фракции
РИС. 8-21.
Один из самых ранних экспериментов 3Н-обмена.
Полипролин (Л) и РПазу (?) инкубировали несколько часов в 3Н20 до достижения максимального обмена. Образцы затем разбавляли водой и через различные промежутки времени наносили на колонку с сефадексом G-25 для разделения белка и 3Н20. На графике А отсутствует 3Н, ассоциированный с полипролином, из чего можно заключить, что либо обмен не происходит, либо он происходит очень быстро. На графике Б показано, что в случае РНазы 3Н связывается с белком. (Воспроизведено с разрешения Englander W.t Biochemistry, 2, 798—807 (1965).]
1. При изучении метаболизма РНК различные фракции РНК обычно идентифицируют зонным центрифугированием или, что
еще лучше, электрофорезом в полиакриламидном геле. Для этого же можно использовать и гель-проникающую хроматографию в
геле агарозы. Пример такого разделения показан на рис. 8-20.
2 Для диагностики некоторых заболеваний человека требуется количественно определить различные фракции белка плазмы. Это можно осуществить прямо на геле декстрана. Такая процедура лежит в основе удобного теста на макро- и гиперглобули-немию.
3. Тритиевый обмен служит методом исследования структуры бейка или ДНК (гл. 18). При этом требуется быстрое отделение макромолекул от 3НгО. Такого разделения можно достигнуть с использованием заряженного геля в течение 10 с, поскольку 3НгО сильно удерживается всеми гелями. Если поры имеют минимальный размер, макромолекулы выходят прямо с холостым объемом или вскоре после него. Пример этой операции показан на рис. 8-21.
4. Гель-проникающую хроматографию можно применять для изучения связывания между белками и небольшими молекулами либо путем разделения продукта и реагентов, либо с помощью пропускания белка через колонку, уравновешенную небольшими молекулами. Простой расчет позволяет определить константу связывания. Большая ценность метода гель-проникающей хроматографии в изучении химического равновесия обусловлена тем, что колонка может работать в широких пределах концентраций, Рн, ионной силы и температуры элюирующего буфера, поскольку размер пор в геле не зависит от этих факторов.
Тонкослойная гель-проникающая хроматография
Как отмечалось выше, достоинствами тонкослойной хроматографии являются быстрое разделение, высокая чувствительность, простое оборудование, легкое элюирование и способность заменять хроматографию на бумаге в качестве аналитического метода. Тонкослойная гель-проникающая хроматография соединяет в себе преимущества обоих методов.
Тонкослойная гель-проникающая хроматография напоминает тонкослойную хроматографию тем, что здесь материал также наносится тонким слоем на стеклянную пластинку, образец вводится в виде точки, а подвижная фаза движется вдоль слоя. Однако есть и существенные различия:
1. В тонкослойной хроматографии сорбент высушивается перед нанесением образца. Гель же сушить нельзя, более того, он легко дегидратируется, поэтому в тонкослойной гель-проникающей хроматографии образец наносится на влажный гель, уравновешенный требуемым растворителем.
2. Тонкослойная хроматография осуществляется восходящим методом, тогда как в тонкослойной гель-проникающей хроматографии применяется нисходящий метод (рис. 8-7). Пластинку помещают в герметичную камеру, причем оба ее конца соединяют
1
/
РИС. 8-22.
Схема проведения тонкослойной гель-проникающей хроматографии.
Гель и фильтровальную бумагу обычно закрывают каким-либо способом для предотвращения высыхания. 1 — полоска фильтровальной бумаги; 2 — тонкий слой геля; 3 — фильтровальная бумага; 4 — стеклянная пластинка; 5 — растворитель; 6 — растворитель для проявления.
с сосудами с помощью мостиков из фильтровальной бумаги (рис. 8-22). Жидкость движется через слой сорбснта, причем скорость тока определяется углом наклона пластинки (обычно 20°). Как и в тонкослойной хроматографии, пробег заканчивается до того, как интересующее вещество перейдет в нижний сосуд. Однако здесь применяется проток жидкости, т. е. в отличие от тонкослойной хроматографии в этом случае отсутствует фронт растворителя. Поэтому в тонкослойной гель-проникающей хроматографии не измеряют значения а положения пятен определяют относительно выбранного стандарта.
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed