Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Васьковского и Костецкого (см. выше).
3. Прогревают пластинку при 120 °С до появления окрашивания. Гликолиппды
окрашиваются в фиолетово-голубой цвет, а другие полярные липиды - в
желтый цвет.
3.4.6. Обнаружение ганглиозидов
Ганглиозиды можно выявить с помощью резорцинового реагента [5].
а. Растворяют 2 г резорцинола в 100 мл дистиллированной воды. Этот
раствор не разлагается при хранении. Не менее чем за 4 ч до использования
добавляют 10 мл этого раствора к 80 мл концентрированной НС1, в которую
было добавлено 0,5 мл 0,1 М сульфата меди (2,5 г CuS04-5H:0 в 100 мл
воды), и доливают до 100 мл дистиллированной водой.
1. Высушивают пластинку после проявления и опрыскивают ее реагентом а).
2. Накрывают хроматографическую пластинку стеклянной пластинкой такого же
размера и нагревают до 120°С. Ганглиозиды обнаруживаются в виде
голубовато-фиолетовых пятен.
4. Количественное определение липидов после разделения их с помощью
ТСХ
4.1. Элюирование липидов
Для дальнейшего анализа липиды можно элюировать с тонкослойных пластинок
с помощью следующей процедуры.
1. Очерчивают липидное пятно кончиком иглы, острым шпателем или
кусочком стекла. Этим же инструментом рассекают пятно горизонтальными и
вертикальными линиями.
172
Глава 4
2. Кладут пластинку на лист бумаги с гладкой поверхностью и с помощью
кусочка стекла или шпателя полностью соскребают силикагель из помеченных
участков.
3. Собирают в кучку порошок на листе бумаги и, используя его как воронку,
переносят силикагель в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
4. Элюируют липид растворителем, более полярным, чем тот, который обычно
используется при ТСХ данного липида. Для большинства липидов вполне
подходит смесь хлороформ/ метанол (1:1, о/о).
5. Ресуспендируют силикагель в 15 мл растворителя, тщательно перемешивают
на вортексе и осаждают силикагель в настольной центрифуге.
6. Осторожно сливают растворитель или переносят его с помощью
пастеровской пипетки в подходящий сосуд.
7. Повторяют экстракцию несколько раз, используя такие же объемы
растворителя.
8. Объединяют экстракты и удаляют растворитель (разд. 2.5)..
4.2. Определение фосфолипидов
Фосфор, входящий в состав фосфолипидов, можно определить в образцах
элюированных липидов или непосредственно на силикагеле без элюирования с
помощью следующей процедуры, основанной на методе Фиске и Суббароу [17J,
модифицированном Бартлетом [18].
Реагенты
а. Хлорная кислота, 7%.
б. Молибдат аммония, 2,5%.
в. Стандартный раствор фосфата: 3,58 г ЫагНР04-12Н20 в 1 л воды.
Добавляют несколько капель хлороформа, чтобы предотвратить рост
микроорганизмов. Непосредственно перед использованием разбавляют этот
раствор в 10 раз, чтобы получить концентрацию 1 мкмоль/мл.
г. Реагент, содержащий аминонафтолсульфокислоту. Его можно приобрести или
приготовить самим. Для этого смешивают 30 г бисульфата натрия, 5 г
сульфита натрия и 0,5 г 1,2,4-аминонафтолсульфокислоты, растирая их в
ступке. Растворяют в 250 мл дистиллированной воды, выдерживают 3 ч в
темноте, фильтруют и заливают в сосуд из темного стекла. Этот реагент
можно хранить в холодильнике в течение 8 нед.
Методика определения
1. Соскребают силикагель, содержащий фосфолипиды (см. выше), и
переносят его в пробирки из тугоплавкого стекла. Поскольку метод
определения фосфата чрезвычайно чувствителен,
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
173
необходимо позаботиться о чистоте пробирок. Их следует мыть только
детергентами, не содержащими фосфатов, или дистиллированной водой, в
которую добавлено несколько миллилитров концентрированной НС1 на 1 л, а
затем многократно ополаскивать дистиллированной водой, полученной в
стеклянном дистилляторе. Такие же требования предъявляются к чистоте всей
используемой стеклянной посуды. Для приготовления растворов тоже следует
использовать воду, перегнанную в стеклянном дистилляторе.
2. Наливают под тягой 1,5 мл хлорной кислоты в каждую пробирку, используя
стеклянную пипетку с автоматическим дозатором.
3. Прикрывают пробирки стеклянными шариками подходящего размера и
прогревают смесь при 230°С в течение времени, вдвое превышающего то,
которое требуется для изменения окраски раствора от коричнево-бурого до
бесцветного или бледно-желтого (обычно достаточно 30 мин). Эту процедуру
можно проводить в нагревательном блоке или в штативе для микроанализа по
Къельдалю, но обязательно в вытяжном шкафу. Необходимо проявлять особую
осторожность, поскольку при контакте горячей хлорной кислоты с
органическими веществами может произойти взрыв.
4. Охлаждают пробирки. Добавляют 2,5 мл дистиллированной воды. Хорошо
перемешивают и осаждают силикагель центрифугированием.
5. Осторожно отбирают пастеровской пипеткой надосадоч-ную жидкость и
переносят ее в другую пробирку.
6. Добавляют 1,5 мл раствора молибдата аммония и тщательно перемешивают.
Добавляют 0,2 мл реагента, содержащего аминонафтолсульфокислоту, и
тщательно перемешивают.
7. Прикрывают пробирки шариками и нагревают в течение 9 мин в кипящей
