Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 76

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 191 >> Следующая

Предполагаемая статня активации гормонами представлена реакцией 3.
включая ВЭЖХ. Выбор метода зависит от задач исследования. Во многих
эксперимента;' фосфолипиды метят с помощью [32Р]- илн [14С]-инозитола.
Далее .нужные липиды можно идентифицировать по радиоактивной метке и
путем сравнения с аутентичными стандартными образцами.
Ионы кальция затрудняют миграцию фосфатидилинозитол-
4,5-бисфосфата [9] при ТСХ, поэтому для разделения поли-фосфопнозитидов
необходимо использовать пластинки с силикагелем Н. Если пластинки готовят
в лаборатории, следует использовать силикагель Н, содержащий 1 % оксалата
калия в качестве хелатирующего агента [9]. На пластинках с силикагелем Н
в системе растворителей метанол/хлороформ/аммиак/ вода (48 ; 40 : 5 ; 10,
о/о) или н-пропанол/4 н. гидроксид аммония (2:1, о/о) удается отделить
фосфатидилинозитол-4-фос-
CDP-
р
3.3.1. Тонкослойная хроматография полифосфоннозитидов
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
167
фат и фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат от других фосфолипидов (рис. 4.5).
При этом фосфатидилинозитол перекрывается со сфингомиелином,
фосфатидилсерином, фосфатидилэтанол-амином и фосфатидной кислотой. Если
фосфатидилинозитол необходимо отделить, пятно, содержащее этот липид,
выскребают с пластинки, липиды элюируют (см. ниже), вновь наносят их на
хроматографическую пластинку и разделяют, используя одну из систем,
описанных выше. Предложен и другой вариант, при котором фосфоинозитиды и
фосфолипиды разделяют с помощью двумерной хроматографии. В первом случае
используют смесь хлороформ/метанол/28%-ный аммиак (65:38: 8, о/о), а во
втором - смесь бутанол/вода/ледяная уксусная кислота (6:1:1, о/о) [ 10].
3.3.2. Разделение инозитолфосфатов после щелочного гидролиза
Изложенная ниже методика анализа фосфоинозитидов и разделения
инозитолфосфатов основана на работе Бэллоу и др. [11, 12] с модификациями
Эллиса [13], Даунса и Мичелла [141 и описана Ирвином и др. [15]
применительно к выделению инозитолфосфатов из фосфоинозитидов мозга.
Здесь дается один из вариантов методики. При необходимости ее можно
модифицировать для анализа меньших количеств образца.
А. Щелочной гидролиз
1. Липиды в количестве, эквивалентном 10 мг липидного фосфора, смешивают
с 12 мл 1 М КОН и кипятят смесь 30 мин.
2. Охлаждают смесь и доводят pH до 3,0 добавлением муравьиной кислоты.
Удаляют жирные кислоты, образовавшиеся при щелочном гидролизе, промыв
смесь несколько раз гептаном.
Б. Хроматография инозитолфосфатов на колонке с дауэк-сом
1. Доводят pH раствора до 8,0 добавлением аммиака и наносят его на
колонку размером 1,5X3 см с дауэксом 1X8- 400 в формиатной форме.
2. Последовательно элюируют колонку каждым из перечисленных ниже
растворов порциями по 15 мл:
а. 0,1 М муравьиная кислота/0,2 М формиат аммония; вымывает
инозитолмонофосфаты (преимущественно 1-изомер);
б. 0.1 М муравьиная кислота/0,4 М формиат аммония; вымывает
пнозитолбисфосфаты (преимущественно 1,5- и
4,5-изомеры);
в. 0,1 М муравьиная кислота/1,0 М формиат аммония; вымывает
инозитолтрисфосфаты (преимущественно 1,4,5-и 2,4,5-изомеры).
168
Глава 4
В принципе существует большое число изомерных инозитолфосфатов. Однако
изомеры, выделяемые из мозга, состоят преимущественно из 4,5-бисфосфатов
и 1,4,5-трнсфос-
фатов.
3. Обессоливают элюанты добавлением дауэкса 50Н+ (смолу затем удаляют
фильтрованием). Экстракты можно лиофи-лизовать и хранить при -20 °С.
В. Хроматография инозитолфосфатов на бумаге. Инозитол-фосфаты можно
разделить с помощью нисходящей хроматографии на бумаге ватман № 1,
используя систему растворителей изопропанол/насыщ. аммиак/вода (7:5:2,
о/о). После элюирования в течение 5-10 сут значения Ri для трех
инозитолфосфатов составляют: инозитолмонофосфат 0,6; инозитолбис-фосфат
0,35; инозитолтрисфосфат 0,16 [11]. Инозитолфосфаты выявляют с помощью
следующей процедуры.
1. Смешивают 5 мл 60%-ной хлорной кислоты с 10 мл 1 М НС1 и 25 мл 4%-ного
(в/о) молибдата аммония.
2. Водой доводят объем до 100 мл.
3. Опрыскивают хроматограмму этим реагентом.
4. Подсушивают бумагу при комнатной температуре и помещают ее под сильный
источник УФ-излучения.
5. Фосфатсодержащие области обнаруживаются в виде голубых пятен или
полос.
3.3.3. Диализ инозитолфосфатов, продуцируемых клетками в
экспериментальных условиях (см. также Приложение Vl|
Инозитолтрисфосфаты играют во многих клетках важную роль вторичных
посредников. Поэтому часто бывает необходимо в ходе эксперимента
определять не фосфолипиды, а сами фосфорилированные полиолы. Легче всего
это сделать с помощью ионообменных смол типа дауэкс.
1. Останавливают исследуемую реакцию добавлением ТХУ (до 10%) и удаляют
денатурированные белки центрифугированием.
2. Отбирают пробы по 1,0 мл из супернатанта; нейтрализуют их разбавленным
NaOH; доводят объем каждой пробы до 5 мл водой и пропускают через колонку
объемом 1 мл с ионообменной смолой типа дауэкс 1X8 200-400 в формиатной
форме. Колонки лучше всего делать из пастеровских пипеток одноразового
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed