Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
пользования, поместив в их нижнюю часть пробочку из стекловолокна.
3. Элюируют три типа инозитолфосфатов порциями растворов по 15 мл, как
описано выше.
4. Обессоливают и лиофилизуют выделенные фракции перед дальнейшим
исследованием.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
169
5. Фракции растворяют в дистиллированной воде; их можно
идентифицировать с помощью бумажной хроматографии (см. выше), а
количественное определение провести по радиоактивности или фосфату.
3.4. Обнаружение липидов на пластинках для ТСХ
Рассмотрим несколько методов обнаружения липидов на пластинках для ТСХ.
Мы укажем специфические окрашивающие реагенты на липиды вообще, на
фосфолипиды, а также на отдельные типы липидов. Многие реагенты наносят
на слой адсорбента путем равномерного разбрызгивания. Для этого лучше
всего использовать пульверизаторы типа аэрозольных баллончиков. Их можно
приобрести у фирм, производящих пластинки для ТСХ. При необходимости
часть пластинки при опрыскивании можно прикрыть, чтобы реагент не попал
на анализируемые липиды, и окрашивать только стандартные липиды по краям
пластинки.
3.4.1. Пары иода
Метод обнаружения липидов, основанный на окрашивании их парами иода,
наиболее удобен благодаря своей быстроте, универсальности и отсутствию
разрушающего действия на липиды. Пластинки после извлечения из
хроматографической камеры высушивают в вытяжном шкафу и помещают в
закрытую камеру подходящего размера, содержащую несколько кристалликов
иода. Эту камеру необходимо подготовить заранее и держать в теплом месте,
чтобы произошла сублимация иода. Липиды обнаруживаются в виде коричнево-
желтых пятен или полос. Окрашивание может длиться от .нескольких минут до
нескольких часов в зависимости от количества липидов. Пятна осторожно
очерчивают мягким карандашом и ждут, пока улетучится иод. Этот процесс
можно ускорить, нагрев пластинку. Поскольку иод тушит флуоресценцию,
важно, чтобы пятна обесцветились перед определением радиоактивности
липидов в сцинтилляционном счетчике. Оставшиеся следы иода обычно не
мешают при колориметрическом анализе липидов.
3.4.2. Обнаружение фосфолипидов
Для обнаружения фосфатсодержащих липидов наиболее пригоден очень
чувствительный метод Васьковского и Костец-кого [16].
а. Растворяют 16 г молибдата аммония в 120 мл воды.
170
Глава 4
б. К 40 мл концентрированной НС1 добавляют 10 мл ртути и 80 мл раствора
а). Встряхивают смесь в течение 30 мин и фильтруют ее.
в. К 200 мл концентрированной H2S04 добавляют весь раствор б) и остаток
раствора а). Доводят объем смеси до 1 л; хранят ее в бутыли из темного
стекла.
1. После извлечения пластинок из хроматографической камеры дают
возможность растворителю полностью улетучиться и равномерно опрыскивают
пластинку реагентом в). Поскольку этот реагент обладает коррозионными
свойствами, опрыскивание лучше проводить в картонной коробке. Кладут
пластинку на дно коробки, находящейся в вытяжном шкафу, опрыскивают
пластинку, стараясь держать пульверизатор внутри коробки.
2. Через несколько минут фосфолипидсодержащие пятна окрашиваются в темно-
голубой цвет. Эта окраска не мешает при последующем колориметрическом
анализе фосфолипидов.
3.4.3. Обнаружение аминогрупп
Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и другие липиды со свободными
аминогруппами можно обнаружить с помощью нингидрина.
1. Высушивают ТСХ-пластинки после извлечения из хроматографической камеры
и опрыскивают их 0,25%-ным раствором нингидрина в ацетоне.
2. Аминосодержащие липиды обнаруживаются в виде розово-фиолетовых пятен
через 1-2 ч при комнатной температуре и через 15 мин при нагревании
пластинок до 100°С. Работать с нингидриновым реагентом следует в
перчатках.
3.4.4. Обнаружение холинсодержащих липидов
Для выявления хслинсодержащих липидов, т. е. фосфати-дилхолина и
сфингомиелина, используют реагент Драгендорфа И- Готовят следующие
растворы.
а. 1.7 г нитрата висмута растворяют в 100 мл 20%-ной уксусной кислоты.
б. 10 г иодида калия растворяют в 25 мл воды.
в. Смешивают 20 мл раствора а) с 5 мл раствора б) и добавляют 70 мл воды.
Этой смесью опрыскивают пластинку.
1. После извлечения пластинки из хроматографической камеры ее высушивают
и опрыскивают реагентом Драгендорфа.
2. Через несколько минут холинсодержащие липиды выявляются в виде
оранжевых пятен или полос.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
171
3.4.5. Обнаружение гликолипидов
Специфическим красителем для гликолипидов, включая це-реброзиды,
сульфатиды, гликозилдиацилглицериды и ганглио-зиды [5], является а-
нафтол. Готовят следующие растворы.
а. 0,5 г а-нафтола растворяют в 100 мл смеси метанол/вода (1:1).
б. Смешивают 95 мл концентрированной H2SO4 с 5 мл дистиллированной воды.
1. После извлечения пластинки из хроматографической камеры ее высушивают
и опрыскивают раствором а).
2. Высушивают пластинку на воздухе и опрыскивают ее раствором б),
принимая те же меры предосторожности, что и при использовании реагента
