Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода, 25 : 15 : 4 : 2
Хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода, 60 : 50 : 1 : 4 н-
Пропанол/пропионовая кислота/хлороформ/вода, 3 : 2 : 2 : 1
Разделение кислых фосфолипидов
Система 1: ацетон/легкнй петролейный эфир, 1 : 3
Система 2: хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода, 80 : 13: Обе
системы растворителей используют в одном направлении.
Разделение полифосфоинозитидов н-Пропанол/4 М аммиак, 2 : 1
Хлороформ/метанол/4 М аммиак, 9:7:2 Хлороформ/метанол/28%-ный
аммиак/вода. 40 : 48 : 5 : 10
Разделение ганглиозидов Хлороформ/метанол/2,5 М аммиак, 60 : 40 : 9
Пропанол/вода, 7 : 3
Системы длч разделения фосфолипидов в двух направлениях
8:0,3
Направление 1 Хлороформ/метанол/аммиак 65 :35 : 5
Хлороформ/метанол/аммиак 90 : 54 : 11 Хлороформ/метанол/уксусная
кислота/вода, 50 : 20 : 7 : 3
Направление 2 Хлороформ / метанол/ацетон/уксусная кислота/вода, 10 : 2 :
4 : 2 : 1 Хлороформ/метанол/уксусная кислота/вода, 90 : 40 : 12:2
Хлороформ/метанол/40%-ный водный метиламнн/вода, 13 :7:1:1
тон/легкий петролейный эфир (1:3, о/о). Подсушивают пластинку, обдувая ее
азотом, а затем элюируют в том же направлении смесью
хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/ вода (80:13:8:0,3, о/о). В
первой системе растворителей неполярные липиды перемещаются к верхнему
краю пластинки, что позволяет предотвратить их перекрывание с кислыми
фосфолипидами. Используя этот подход, можно разделить кар-диолипин,
фосфатидовую кислоту, церамидмоногексозиды, фос-фатидилглицерол и
фосфатидилэтаноламин (рис. 4.5, В).
3.2.4. Разделение фосфолипидов и лизофосфолипидов
Чтобы разделить смесь лизофосфолипидов и фосфолипидов, образующихся,
например, после обработки мембран фосфоли-пазой А, необходимо
использовать двумерную ТСХ. Для разделения подходят две системы:
хлороформ/метанол/аммиак
(65 : 35 : 5, о/о) и хлороформ/метанол/ацетон/уксусная кислота/вода
(10:2:4:2:1, о,/'о) (рис. 4.5,Ж). Стандартные об-
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
165
разцы следует хроматографировать по крайней мере в первом направлении,
чтобы уточнить локализацию изучаемых липидов. Для идентификации липидов
можно также использовать специфические красители (см. ниже).
3.2.5. Разделение ганглиозидов
Ганглиозиды - минорные компоненты мембран, играющие важную роль в
осуществлении некоторых мембранных функций. Они представляют собой
сложные цереброзиды, в которых церамидный фрагмент связан с углеводным,
содержащим остатки глюкозы, галактозамина и сиаловой кислоты. Имеется
много типов ганглиозидов, различающихся по структуре углеводной части, но
их детальное рассмотрение не входит в задачи этого раздела. Системы
растворителей, пригодные для разделения ганглиозидов, включают смеси
пропанол/вода (7 : 3, о/о) (рис. 4.5, Г) или хлороформ/метанол/2,5 М.
аммиак (60 : 4: 9, о/о). Системы, содержащие кислоты, использовать не
следует, поскольку они вызывают разложение ганглиозидов.
3.2.6. Разделение промежуточных продуктов, образующихся при метилировании
фосфатидилэтаноламина до фосфатидилхолина
Метилирование фосфатидилэтаноламина, как полагают, происходит при
опосредуемом рецепторами отклике ряда клеток на гормоны.
Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилмонометил-этаноламин,
фосфатидилдиметилэтаноламин и фосфатидилхо-лин разделяют на силикагеле,
используя систему растворителей н-пропансл/пропионовая
кислота/хлороформ/вода (3:2:2: 1, о/о) (рис. 4.5, Д). Эта система
пригодна также для разделения основных классов фосфолипидов, которые
образуют в ней узкие полосы. Недостаток системы состоит в том, что
разделение на пластинке длиной 20 см длится примерно 4 ч, тогда как для
систем, указанных выше, на это уходит 1,5- 2 ч.
3.3. Разделение полифосфоинозитидов и их производных
Полифосфоинозитиды играют главную роль при передаче сигналов в ответ на
действие гормонов, нейромедиаторов и ростовых факторов. Первая реакция на
гормон или лиганд состоит в ускорении гидролиза фосфатидилинозитол-4,5-
бис-фосфата до диацилглицерола и инозитол-1,4,5-трисфосфата (рис. 4.6).
Оба они функционируют как вторичные посредники: диацилглицерол активирует
протеинкиназу С, а инозитол-трисфосфат мобилизирует кальций из
мембраносвязанных де-
166
Глава 4
по, таких, как цистерны эндоплазматического ретикулума [lj.
Инозитолтрисфосфат подвергается дальнейшему гидролизу, давая
ннозитолбисфосфат, инозитолмонофосфат и, наконец, инозитол. Последний
затем включается в фосфатидилинозитол, который фосфорилируется с
образованием сначала фосфати-дилинозитол-4-фосфата, а затем
фосфатидилинознтол-4,5-бис-фосфата (см. Приложение IV).
Три указанных выше фосфоинозитида можно разделить с помощью ТСХ суммарных
фосфолипидов. Другой подход состоит в щелочном гидролизе фосфолипидов с
последующим разделением образовавшихся инозитолфосфатов с помощью
хроматографии на бумаге пли ионообменной хроматографии,
PI PIA.P Р1Л5.Р, eg
Рис. 4.6. Взаимопревращения полифосфоннозитидов (детали см. в тексте).
