Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
возможности детально рассмотреть все методы; для этого читателю следует
обратиться к соответствующим пособиям [5-7J. Как правило, при мембранных
исследованиях имеют дело с относительно небольшими количествами липидов.
По
Рис. 4.2. Приспособление для испарения растворителей из липидных
экстрактов. Оно состоит из грушевидной колбы (У) на шлнфе, соединенной с
ловушкой (2), которая с помощью шланга связана с вакуумным водоструйным
насосом через охлаждаемую колбу (3). Липидный экстракт вносят в
грушевидную колбу, которую нагревают в водяной бане (4) при осторожном
перемешивании. Растворитель испаряется и конденсируется в охлаждаемой
колбе, а липиды остаются в грушевидной колбе.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
15Г
этой причине для разделения мембранных липидов чаще всего применяют ТСХ
на силикагеле. Этот метод, довольно быстрый и чрезвычайно удобный, дает
возможность проводить как качественный, так и количественный анализ
липидов различных классов. Поэтому ниже мы рассмотрим вопросы
практического применения ТСХ и укажем ряд систем, используемых для
анализа мембранных липидов. Кроме того, мы опишем методы разделения
полифосфоинозитидов и инозитолфосфатовг а также продуктов метилирования
фосфатидилэтаноламина, учитывая важность этих липидов в исследовании
мембран.
3.1. Общие вопросы применения ТСХ
3.1.1. Аппаратура
1. Хроматографические пластинки. ТСХ обычно проводяг в тонком слое
силикагеля, нанесенном на подложку - стеклянную, пластиковую или
алюминиевую пластинку. Можно использовать и другие адсорбенты, например
оксид алюминия, целлюлозу или сефарозу. Силикагель бывает с кальциевой
связующей добавкой (силикагель G) или без нее (силикагель Н). В продаже
имеется большой выбор готовых к употреблению пластинок разного размера
(например, Merck, Analabs), Хроматографические пластинки можно
приготовить и прямо в лаборатории с помощью специальных приспособлений,
таких, как аппликатор типа Desaga (Brinkman Instruments). Однако если не
предполагается использовать какие-то уникальные адсорбенты или если для
анализа не нужно много пластинок, то вряд ли целесообразно самому
заниматься их изготовлением; лучше купить готовые. В тех случаях, когда
это заранее не оговорено, все хроматографические анализы, описанные ниже,
проведены "а пластинках размером 20x20 см в слое силикагеля Н толщиной
0,25 мм, иногда с добавлением флуоресцентного индикатора F254
(силикагельные пластинки фирмы Merck типа 60F254 или пластинки с
силикагелем Н фирмы Analab).
2. Хроматографические камеры. Для разделения используют прямоугольные
камеры. Стенки камеры выстилают изнутри фильтровальной бумагой, чтобы
ускорить ее насыщение парами растворителя. Если атмосфера внутри камеры
не насыщена и растворитель испаряется из слоя адсорбента в процессе
восходящей хроматографии, может ухудшиться воспроизводимость результатов.
Камеру следует подготовить по крайней мере за час до проведения
хроматографии, залив в нее достаточное количество растворителя (см. ниже)
на глубину около 1,5 см. Фильтровальная бумага, выстилающая стенки
камеры, должна пропитаться растворителем. Необходимо, чтобы крышка ка-
158
Глава 4
меры плотно прилегала к краям; для этого их необходимо смазать
вазелиновой смазкой. Крышку можно снимать только на короткое время, чтобы
поместить пластинку, затем камеру необходимо плотно закрыть. В продаже
имеются разные камеры. У некоторых из них есть желобки, предназначенные
для размещения большого числа пластинок. Однако, по нашему мнению, если
пластинки расположены слишком близко друг к другу, то не удается добиться
качественного и воспроизводимого разделения липидов. В одну камеру
следует одновременно помещать не более двух пластинок, причем так, чтобы
поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а
слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Слой
адсорбента не должен соприкасаться с боковыми стенками камеры, в
противном случае растворитель будет подниматься быстрее по краям
пластинки, что приведет к искривлению фронта растворителя. При этом
липидные пятна будут смещаться к центру н перекрываться вместо того,
чтобы равномерно мигрировать вверх по пластинке.
3.1.2. Нанесение образцов
Для хорошего разделения липидов, особенно в условиях повышенной влажности
и температуры, рекомендуется активировать хроматографические пластинки,
прогрев их при 110°С в течение 30 мнн. После охлаждения образцы,
предназначенные для разделения, наносят на расстоянии приблизительно
2,5 см от края пластинки. Чтобы свести к минимуму растекание
растворителя по адсорбенту, липиды следует растворить в достаточно
полярном растворителе, например в смеси хлороформ/метанол (1 : 1). При
этом уменьшается размер пятна и улучшается разделение. В соответствии с
числом образцов, подлежащих разделению, тонкослойные пластинки можно
аккуратно расчертить мягким карандашом, стараясь не повредить слой
