Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
прибегать к использованию полярных растворителей, таких, как метанол или
этанол, которые разрушают мембранные структуры и денатурируют мембранные
белки. Чаще всего для экстракции мембранных липидов используют смеси
растворителей, содержащие хлороформ и метанол; впервые соответствующие
методики были описаны в работе [3]. Получаемый экстракт может быть
загрязнен веществами нелипидной природы, и для их удаления его следует
промыть. Для экстракции липидов из тканей используют различные методики.
Ниже описаны те из них, которые чаще всего применяются для извлечения
мембранных липидов. Выбор методики зависит главным образом от того,
находится ли экстрагируемая мембрана в виде осадка, концентрированной
суспензии или разбавленной взвеси.
2.1. Растворители и аппаратура
Все процедуры по экстракции липидов следует проводить в стеклянной
посуде, применяя перегнанные растворители или растворители квалификации
ЧДА. Для измерения объема растворителей и отбора проб липидных экстрактов
следует использовать стеклянные дозаторы или стеклянные пипетки. Для
измерения объема липидных экстрактов можно использовать также
автоматические пипетки, однако сначала следует убедиться в точности
калибровки пипеток применительно к используемым растворителям, а также в
том, что из пластиковых наконечников не экстрагируются посторонние
вещества.
152
Глава 4
Многие липиды имеют двойные связи и, следовательно, подвержены
перекисному окислению. Чтобы избежать окисления, следует применять
перегнанные растворители, а при экстракции сильно ненасыщенных липидов из
растворителя должен быть удален кислород путем пробулькивания азота.
Экстракцию следует проводить при комнатной или более низкой температуре.
Липиды не рекомендуется оставлять в сухом состоянии даже на короткое
время, они должны быть растворены в органическом растворителе. Хранить
экстракты необходимо в холодильнике в посуде из темного стекла или в
сосуде, обернутом алюминиевой фольгой. Если хранение должно быть
длительным или если в экстракте присутствуют сильно ненасыщенные липиды,
то в качестве антиоксиданта следует добавить бутилированный
гидрокситолуол до концентрации 0,05%.
2.2. Экстракция осадка мембран или небольших объемов концентрированных
суспензий
1. Ресуспендируют мембранный осадок или диспергируют имеющуюся суспензию
в стеклянных центрифужных пробирках, содержащих не менее 20 объемов смеси
хлороформ/метанол (2: 1, о/о). Если мембраны выделены из
гомогенизированных тканей и легко ресуспендируются, обычно нет
необходимости дополнительно гомогенизировать тканевой экстракт. Однако
при диспергировании мембранных препаратов в смеси хлороформ/метанол
образуются сгустки. Такие препараты лучше экстрагировать, добавив сначала
один метанол в требуемом количестве, затем диспергировать смесь на
вортексе или аналогичном встряхивателе или, если этого недостаточно, на
гомогенизаторе типа Polytron или Ultraturax (см. гл. 1) и лишь после
этого добавить хлороформ в объеме, необходимом для получения смеси
хлороформ/метанол конечного состава 2 : Е
При добавлении двадцати объемов смеси хлороформ/метанол на один объем
осадка или суспензии мембран должна образоваться гомогенная однофазная
суспензия. Если же получаются две фазы, то следует добавить еще некоторый
объем смеси хлороформ/метанол (2:1) и хорошо перемешать до тех пор, пока
не образуется одна фаза.
2. Накрывают пробирки, чтобы предотвратить испарение, и оставляют
экстракт не менее чем на 15 мин (при необходимости время можно
увеличить); удаляют денатурированный белок центрифугированием и сливают
надосадочную жидкость в стеклянные центрифужные пробирки.
3. Добавляют к экстракту одну пятую объема 0,05 М СаС12 и тщательно
перемешивают на встряхивателе типа вортекс или с помощью стеклянной
палочки, сплющенной на конце.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
153
При этом должна образоваться однородная эмульсия. Для разделения на две
фазы ее оставляют отстаиваться или центрифугируют на настольной
центрифуге.
4. С помощью пастеровской пипетки осторожно удаляют верхнюю фазу, которая
состоит из смеси хлороформ/метанол/ вода, 3:42:47. Нижняя фаза состоит
главным образом из хлороформа и содержит все липиды, за исключением
ганглио-зидов. Последние остаются в верхней фазе, из которой их можно
выделить диализом против воды с последующей лиофили-зацией.
5. Нижнюю фазу можно промыть, добавив равный объем смеси метанол/вода
смешав и отцентрифугировав для разделения фаз.
Следует ли промывать липидный экстракт и если да, то сколько раз -
зависит от задач конкретного исследования. Например, если определяют
включение в липиды радиоактивных предшественников (скажем, пальмитоил-
СоА, S-адено-зилметионина, холина или этанол амина), то в липидный
экстракт может попасть значительное количество радиоактивного субстрата.
В этом случае целесообразно промыть экстракт. Напротив, если необходимо
экстрагировать липиды с высоким выходом, а небольшое присутствие
