Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 66

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 191 >> Следующая

для иммуноблоттинга белков, без акриламидного геля) таким образом, чтобы
колонии располагались со стороны катода, и проводят электрофорез в
течение 30 мин при 50 В. Это обеспечивает прочное прикрепление белков,
содержащихся в колониях, к нитроцеллюлозе и удаление избытка ДСН.
Электрофорез можно проводить в специальных емкостях, позволяющих
использовать большие фильтры; можно также разрезать фильтры так, чтобы
они входили в обычные аппараты для блоттинга.
В. Инкубация с антителами, проявление и окрашивание
Фильтры инкубируют, используя PBS, pH 7,4, содержащий 0,5% (в/о) желатины
[или 10% (в/в) лошадиной сыворотки] и 0,1% (в/в) тритона Х-100, если
это не оговорено особо, по следующей схеме.
1. Промывают фильтры 5 мин в буфере.
2. Промывают фильтры 20 мин в буфере с добавлением ДНКазы до конечной
концентрации 10 мкг/мл.
3. Промывают фильтры дважды по 5 мнн.
4. Помещают фильтр между сухими листами бумаги ватман ЗММ и прокатывают
круглой палочкой для удаления обломков бактериальных клеток
5. Инкубируют 60 мин с первыми антителами. Обычно используют IgG в
концентрации 1 мкг/мл в буфере, содержащем белок Е. coli, который
добавляют для предотвращения неспецифического связывания с колониями.
6. Промывают фильтры три раза по 5 мин.
7. Инкубируют фильтры 60 мин со вторыми антителами, меченными перок-
сидазой хрена (антитела, производимые фирмой TAGO Inc., Barlinghame, USA,
в разведении 1; 2000).
8. Промывают фильтры три раза по 5 мин.
9. Промывают фильтры PBS два раза по 5 мин.
10. Проявляют фильтры в 0,1 М трис-НС1, pH 7,4, содержащем 0,5 мг/мл
3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида и 1 : 5000 Н202.
Иммунологические методы исследования мембран
14S
Продолжение
11. Помечают позитивные колонии, а затем окрашивают фильтр красителем
понсо S. Позитивные колонии берут с исходной пластины. Объем жидкости,
используемой для промывания, составляет 20-30 мл на квадратный фильтр
размером 24x24 см.
пользовать антитела, позволяющие выявлять 10 нг белка при стандартной
.процедуре иммуноблоттинга.
Вопрос о том, какие антитела - поликлональные или моноклональные- лучше
применять для первичного скрининга, пока не решен. Весьма привлекательным
представляется использование аффинно очищенных поликлональных антител,
поскольку при этом выявляется любой из нескольких эпитопов исходного
белка. Однако при скрининге по экспрессии будет увеличиваться вероятность
получения ложнопозитивных результатов из-за присутствия поликлональных
антител против любых загрязнений в иммуногене, поскольку загрязняющий
компонент может продуцироваться в такой же концентрации, что и нужный
антиген. В качестве компромиссного варианта можно рекомендовать отбор
клонов с помощью аффинно очищенных поликлональных антител и
моноклональных антител [36, 124]; с успехом использовались и смеси
нескольких моноклональных антител [128]. О получении позитивных клонов
можно говорить более или менее уверенно, если выделены соответствующие
колонии и проведен вторичный скрининг, а также иммуноблоттинг слитного
белка, аффинная очистка антител на слитном белке с последующим блоттингом
на препарате исходного антигена и .проверены реакции с несколькими
антителами. Однако для полной уверенности необходимо провести
секвенирование и сравнить полученные данные с тем, что известно о
первичной структуре белка. Это могут быть данные об аминокислотном
составе белка, первичной структуре его фрагментов и/или о каких-то сайтах
протеолитического расщепления.
6.4. Перспективы
Несмотря на то что при использовании антител в качестве зондов для
клонирования по экспрессии могут получаться ложнопозитивные результаты
[129], этот метод находит все более широкое применение. Векторы для
экспрессии рекомбинантных продуктов могут оказаться особенно ценными при
исследовании топографии мембранных белков. Так, можно создать систему для
синтеза in vitro определенных участков белковых молекул и использовать их
для получения антител заданной специфичности. С помощью этих антител
можно попытаться установить топографию белка в составе мембраны. Кроме
того, появится возможность получать антитела к определенным доменам
мембранных
10-1488
146
Глава 3
белков для таких целей, как модификация функции белка или применение их в
качестве первых антител при иммуноаффинном •выделении определенных
органелл. Такие антитела с заранее заданной специфичностью без сомнения
окажутся очень ценными для последующих исследований структуры и функций
клеточных мембран.
7. Благодарности
Мы благодарны профессору С. N. Hales, д-ру К- Siddle, д-ру 'К- К- Stanley
и д-ру К- Howell за многочисленные полезные и плодотворные дискуссии.
Экспериментальные работы авторов, упоминающиеся в этой статье,
субсидировали следующие организации: Medical Research Council, the
Arthritis and Rheumatism ¦Council, the British Diabetic Association, the
Beit Foundation, the European Molecular Biology Organisation, St. John's
College, •Cambridge, IQ Bio ltd, Cambridge, Muscular Dystrosphy Group of
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed