Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
тем чтобы найти •оптимальные условия выделения с высоким выходом за
наиболее короткое время.
4.2. Носители для иммуноаффинного субклеточного фракционирования
Выбор носителя для аффинной очистки субклеточных частиц определяется
рядом факторов; наиболее важные из них - высокая емкость, отсутствие пор,
наличие подходящих "ножек", низкий уровень неспецифического связывания,
легкость отделения несвязавшегося материала и доступность носителя. По
ряду причин для выделения субклеточных фракций рекомендуется использовать
носители с высокой емкостью. Например, в случае непрямого выделения,
несмотря на интенсивное отмывание, в системе всегда будет присутствовать
какое-то количество несвязанных первых антител. Эти свободные антитела
будут успешно конкурировать со связанными антителами за места связывания
на иммуносорбенте. Кроме того, связывание субклеточных частиц с
иммуносорбентом будет тем эффективнее, чем больше потенциальных мест
связывания на поверхности как сорбента, так и выделяемых частиц.
Емкость любого иммуносорбента определяется в основном числом мест
связывания для взаимодействующих с IgG молекул
9*
132
Глава 3
(обычно вторых антител) и степенью инактивации этих молекул при
ковалентном пришивании к носителю. Наиболее часто используются непористые
носители (например, сефароза 6МВ, полиакриламид, целлюлоза), поскольку
они обладают наибольшей емкостью поверхностного связывания. Высокой
суммарной емкостью обладают и пористные носители, например сефароза 4В,
однако большая часть мест связывания находится в порах и недоступна для
относительно крупных клеточных органелл. Самая высокая емкость связывания
(определенная по количеству присоединенного IgG), о которой сообщалось в
литературе [57], наблюдалась для второго моноклонального антитела,
присоединенного к целлюлозе [66-68]. Целлюлозные носители очень удобны
при разделении связанных и несвязанных частиц, поскольку при этом можно
использовать низкоскоростное центрифугирование. В случае других носителей
для разделения используют колоночную хроматографию или магнитные свойства
частиц. В последнем варианте, применяемом в системах со свободным
потоком, магнитные частицы оказываются суспендированными, и это
существенно уменьшает неспецифическое связывание [51].
Иммуноаффинное выделение субклеточных фракций позволяет получать
значительно более чистые препараты, чем классические методы. Степень
загрязнения можно оценить по связыванию органелл с носителем в отсутствие
первичных антител, а также по количеству определенного загрязняющего
компонента, выделяемого вместе с нужной частицей. Неспецифическое
связывание с носителем определяется как используемым количеством
носителя, так и количеством уже связавшегося белка. Существуют разные
способы оценки эффективности процесса адсорбции [51], но наиболее
информативным параметром является отношение уровней специфического и
неспецифического связывания, которое отражает степень очистки ([52];
табл. 3.5). Это отношение уменьшается с увеличением количества носителя,
приходящегося на определенное количество частиц в ходе адсорбции.
Следовательно, применение иммуносорбентов с высокой емкостью будет
повышать эффективность процесса за счет снижения необходимого для очистки
количества иммуносорбента.
4.3. Практические вопросы и возможности применения иммуноаффинного
выделения клеточных органелл
В целом для выделения субклеточных структур наиболее подходящими
представляются методы непрямой иммуноаффин-ной очистки. Нужно, чтобы
первые антитела обладали высокой специфичностью и авидностью и были
направлены против анти-
Иммунологические методы исследования мембран
гзз
Таблица 3.6. Иммуноаффинное выделение холинергических нервных окончаний
(см. также табл. 5.5)
1. Соскребают 1 г коры мозга крыс п готовят 10%-ный гомогенат ткани в
11%-ном растворе сахарозы1*. Для этого ткань помещают в гомогенизатор со
слабо притертым тефлоновым пестиком и гомогенизируют 12 ходами при
скорости 640 об/мин. Хранят гомогенат при 4 СС.
2. Центрифугируют прн 1000 g в течение 10 мин, отбирают супернатант и
центрифугируют при 18 000 g в течение 20 мин. Доводят объем осадка до 10
мл раствором сахарозы.
3. Разделяют полученный раствор на две порции по 5 мл. Инкубируют одну
часть с бараньей сывороткой анти-(Ою1-1) (разведения 1:25-1:200), а
другую - с неиммунной бараньей сывороткой в том же разведении. Инкубацию
проводят при 4 С.С в течение 40 мин с периодическим встряхиванием.
Доводят объем до 30 мл раствором сахарозы.
4. Центрифугируют при 18 000g в течение 15 мин (центрифуга Sorvall SS-34,
14 000 об/мнн).
5. Промывают осадки три раза по 30 мл раствором сахарозы, каждый раз
центрифугируя их при той же скорости.
6. Осадки ресуспендируют в 3 мл перколла2* и (см. гл. I) центрифугируют
прн 9000 g в течение 2 мин. Отбирают верхний слой, содержащий нервные
окончания, разбавляют буфером KRH/ЭДТА3* и еще раз центрифугируют.
7. Инкубируют аликвоты объемом 200 мкл с 1-2 мг иммуносорбента4* в общем
