Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 62

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 191 >> Следующая

кислот и конъюгированные соли желчных кислот, CHAPS) образуют мицеллы с
низкой мол. массой и для них характерны высокие значения ККМ. Эти
детергенты, взаимодействуя с мембранными белками, образуют монослой,
покрывающий гидрофобные участки этих молекул [73].
Более подробная информация о свойствах некоторых детергентов приведена в
гл. 5.
Чтобы определить, присутствует ли в солюбилизированной молекуле
связывающийся с мембраной участок, можно использовать электрофорез со
сдвигом заряда [74] (см. Приложение V). Если белок был солюбилизирован
благодаря связыванию с мицеллами нейтрального детергента, то при
добавлении анионного детергента, который встраивается в мицеллы, будет
наблюдаться увеличение электрофоретической подвижности белка [2]. Если
такое увеличение отсутствует, то это предполагает, что белок был
солюбилизирован не благодаря связыванию с детергентом и поэтому не
содержит связывающегося с мембраной домена.
5.1.2. Критерии солюбилизации
Для подбора оптимального детергента для солюбилизации данного белка
целесообразно приготовить нужную мембранную фракцию, в которой содержится
этот белок, и хранить ее, разделив на несколько порций, при -70 °С; тогда
все эксперименты можно будет провести на одном препарате мембран (см.
также гл. 5).
136
Глава 3
1. Седиментация при высоких g. Следует определить выход белка из
мембран, ресуспендированных до конечной концентрации белка 5 мг/мл, под
действием детергента в концентрации 0,2-3% (в/о) при комнатной
температуре и при 4°С. Для этого мембраны инкубируют с детергентом в
течение 30 мин, центрифугируют при 100 ООО g 60 мин и определяют
активность и суммарное содержание белка в супернатанте и в исходном неот-
центрифугнрованном образце. Эти опыты можно проводить в маленьких
пластмассовых пробирках, поместив их по нескольку штук в наполненные
водой пробирки для ультрацентрифуги и центрифугируя их все вместе. Если
при добавлении детергента происходит инактивация белков, то при
солюбилизации используют стабилизирующие агенты (например, глицерол),
восстанавливающие и хелатирующие вещества, ингибиторы протеаз (гл. 1).
2. Фракционирование по размерам. Если данный белок не осаждается после
центрифугирования при больших g, мы еще не можем говорить, что произошла
его полная солюбилизация [75]. Необходимо определить его размер с помощью
электрофореза в ПААГ или гель-фильтрации (см. также гл. 6). Преимущества
и недостатки использования электрофореза в ПААГ обсуждаются в работе
[76], где подробно описаны также несколько буферных систем для
электрофореза в диапазоне pH 5,2- 10,9. Подходящими средами для первых
пробных экспериментов по гель-фильтрации являются сефароза 6В (Pharmacia)
или ультрогель АсА22 (LKB), для которых предельное значение мол. массы
частиц, выходящих в исключенном объеме, составляет ~103 кДа.
Солюбилизированные белки должны выходить во внутреннем объеме колонки.
Мол. массу солюбилизированных белков можно оценить, сравнив их /?,- со
значением этого параметра для стандартных белков при гель-фильтрации и
электрофорезе в ПААГ. Однако получаемые при этом значения молекулярных
масс мембранных белков будут относительными из-за влияния связывания их с
детергентом, различий в форме молекул и в относительном удельном объеме
комплексов детергентов с мембранами и с растворимыми белками,
используемыми при калибровке. Величина этой систематической ошибки
неизвестна. Тем не менее сравнение размеров белков в различных
детергентах полезно для определения степени их солюбилизации.
Солюбилизация в детергентах сильно сказывается на гидрофобных
взаимодействиях мембранных белков с липидами и другими белками, влияние
же детергента на гидрофильные взаимодействия маловероятно. Например, как
было показано в одной из работ [77], HLA-антигены, выделенные методом
иммуноаф-финнон хроматографии, были в значительной степени загрязне-
Иммунологические методы исследования мембран
137
ны цитоплазматическим актином, и это загрязнение удавалось устранить
предварительной обработкой мембран буфером с низкой ионной силой,
содержащим АТР и дитиотреитол. Если есть основания полагать, что может
произойти загрязнение каким-то другим белком, то в самом начале
солюбилизации следует использовать буферы с различной ионной силой.
Очистка солюбилизированных с помощью детергентов мембранных белков с
использованием моноклональных антител описана в разд. 5.2. При переходе
от аналитических исследований к выделению на препаративном уровне может
оказаться необходимым повысить концентрацию детергента, поскольку
соотношение между детергентом и липидами, детергентом и белком, а также
абсолютная концентрация детергента влияют на эффективность солюбилизации.
Например, для солюбилизации всей 5'-нуклеотидазы из плазматических
мембран при концентрации белка 3 мг/мл было достаточно 0,5% (в/о)
детергента сульфобетаина 14, но при более высоких концентрациях белка и
липидов для полной солюбилизации в ходе препаративного выделения
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed