Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 61

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 55 56 57 58 59 60 < 61 > 62 63 64 65 66 67 .. 191 >> Следующая

объеме 500 мкл, тщательно перемешивая. Инкубируют при 4°С в течение 40
мин, время от времени перемешивая на вортексе.
8. Отделяют связанные н несвязанные нервные окончания. Для этого
добавляют 2,5 мл перколла, перемешивают н центрифугируют при 9000 g в
течение 2 мин.
9. Отбрасывают супернатант. Промывают иммуносорбент три раза перколлом
(по 2,5 мл) и один раз буфером KRH5*.
') 11%-ный раствор сахарозы: 0,32 М сахароза в 1 мМ ЭДТА, S ыМ HEPES pH
7,4. 2) Раствор перколла: 454, перколла в буфере KRH/ЭДТА (в/в); см.
сноску *).
?) Буфер KRH/ЭДТА: KRH (см. сноску ')) 1 1 мМ ЭДТА, pH 7,4, без Са!+ и
MgJ+. *) Иммуиосорбент: целлюлоза со связанными моноклональными
антителами мыши против IgG барана (~0.3 мг мышиных IgG на 1 мг
целлюлозы).
б) Буфер KRH: 140 мМ NaCl. 5мМ КС1. 2,6 мМ СаСЬ, 2 мМ MgCla. 5 мМ
глюкоза, 10 мМ HEPES, pH 7,4.
генов, присутствующих в выделяемых органеллах в большом количестве.
Иммуносорбент должен обладать низким уровнем неспецифического связывания
и высокой емкостью, что обеспечивается высокой авидностью вторых антител.
Инкубация и все процедуры промывания должны проводиться в мягких
условиях, чтобы предотвратить разрушение органелл и образование везикул
из мембран [51]. В табл. 3.6 описан метод иммуноаффинного выделения
холинергических синаптосом (нервных окончаний) из мозга крысы [57].
Подбирая подходящие первые антитела и внося необходимые изменения в
методику, можно выделять мембраны и органеллы из клеток других тканей
и/или других видов животных.
О возможностях применения иммуноаффинных методов для выделения
субклеточных компонентов можно судить по данным,
134
Глвва 3
представленным в табл. 3.5. Иммуноаффинные методы применяли для выделения
самых разных органелл: от холинергиче-ских синаптосом, присутствующих в
гомогенате мозга крыс [57], до покрытых клатрином везикул [61]. Эти
методы позволяют получать необходимые фракции через два часа после
добавления антител и разделять нормальные и вывернутые везикулы (рис.
3.2) [56], что может иметь большое значение для последующих
функциональных исследований. Обычно для отделения мембранных фракций от
иммуносорбента приходится использовать жесткие условия; однако эта
процедура часто оказывается не нужной, поскольку в большинстве случаев
выделяемые им-муноаффинными методами частицы сохраняют свои биохимические
свойства и в связанном с сорбентом состоянии.
5. Иммунологическое выделение мембранных компонентов
5.1. Солюбилизация мембранных белков
Мембранные белки подразделяют на наружные и внутренние (интегральные) в
соответствии с теми методами, которые используются для их солюбилизации
[69]. Чтобы можно было исследовать и выделить интегральные белки, их
необходимо экстрагировать из мембранного липидного бислоя н встроить в
де-тергентные мицеллы.
Исследователи, работающие в области биохимии мембран, располагают широким
набором детергентов с разной химической структурой; их свойства
рассмотрены в гл. 5. В первых работах по солюбилизации мембранных белков
для получения водных растворов амфифильных белков удаляли гидрофобную
часть молекулы протеолизом [70] и исследовали растворимый гидрофильный
фрагмент, обладающий биологической активностью. Такой подход с
расчленением мембранного белка на домены особенно ценен, когда он
используется параллельно с солюбилизацией с помощью детергентов, которая
дает возможность получать интактные молекулы. Однако он не может
считаться оптимальным, поскольку не все мембранные белки удается
расщепить так, чтобы образовывались гидрофобный и гидрофильный домены.
Для выделения некоторых трансмембранных белков используются органические
растворители, например бутанол, однако при этом остается ряд неясных
моментов. Так, при солюбилизации с помощью бутанола щелочной фосфатазы,
возможно, происходит активация эндогенной фосфолипазы [71], во всяком
случае, экзогенная фосфолипаза С способствует экстракции щелочной
фосфатазы в водный раствор.
Иммунологические методы исследования мембран
135
5.1.1. Свойства детергентов
В зависимости от электрического заряда детергенты можно разделить на
неионные, цвиттерионные, а также анионные или катионные, а по общей
структурной организации - на детергенты типов А и В [72]. Детергенты типа
А (например, октилглю-козид, саркозил, бридж, тритоны серий X и N,
луброл) имеют гидрофильную головку и гибкий гидрофобный хвост. Они
образуют мицеллы с мол. массой 20-90 кДа, в которые встраиваются
гидрофобные участки мембранных белков. Критическая концентрация
мицеллообразования (ККМ) для детергентов типа А, у которых головка
формируется из неионных или цвитте-рионных групп, весьма мала (<1 мМ).
Ниже этих концентраций детергенты существуют в растворе в виде мономеров.
Более высокие значения ККМ для ионных детергентов обусловлены, по-
видимому, взаимным отталкиванием ионных групп, формирующих головки,
поскольку при увеличении ионной силы среды уменьшается ККМ и
увеличивается мол. масса мицелл. Детергент типа В (например, соли желчных
Предыдущая << 1 .. 55 56 57 58 59 60 < 61 > 62 63 64 65 66 67 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed