Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 58

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 191 >> Следующая

гурацией 85 [57]
Холинергические синаптосомы Мозг
Микросомы Печень [50]
Аппарат Гольджи " 9,1 [58]
Лизоеомы " 30 [59]
Окаймленные везикулы Мозг [60, 61]
Синаптические везикулы " [62]
') Эффективность адсорбции определяется как отношение уровней
специфического и неспецифического связывания и относится только к первому
из указанных типов клеток и к первой ссылке. Она зависит от используемого
носителя. Дополнительные ссылки, касающиеся успешного фракционирования
субклеточных фракций с помощью иммуноаф-финных методов и эффективности
адсорбции, приведены в работе [52].
4. Иммунологическая очистка субклеточных фракций
В отличие от методов разделения, основанных на различиях в физических
параметрах органелл (гл. 1 и 2), иммунологические методы разделения
субклеточных компонентов опираются на различия в их биологических
свойствах (например, это может быть различие в экспрессии антигенов).
Наиболее часто используются иммуноаффинные методы, которые позволяют
прозодить очистку быстро и с высоким выходом. Эти методы оказываются
особенно ценными в тех случаях, когда в распоряжении исследователя
имеются лишь небольшие количества материала (например, культуры клеток).
Они имеют и то преимущество, что при этом используются физиологические
солевые растворы и органеллы не подвергаются воздействию необычных сред,
осмотическому или электрическому шоку. С момента появления первого
сообщения об использовании иммуноаффинных методов для фракционирования
субклеточных структур [47] и об успешном выделении конкретных клеточных
органелл [48- 50] прошло довольно много времени, но лишь недавно
иммуноаффинные методы стали широко и эффективно использовать для анализа
различных биологических систем (табл. 3.5). Критерии создания эффектных
методов субклеточного иммуноаффинного фракционирования, сформулированные
в обзорах [51, 52], тре-
128
Глава 3
буют от исследователей внимания как к свойствам используемых антител, так
и к природе применяемых твердофазных носителей.
4.1. Антитела, использующиеся при субклеточном фракционировании
Иммуноаффинные методы, использующиеся для субклеточного фракционирования,
можно разделить на две категории: методы с применением прямых
иммуносорбентов, когда антитела против определенных органелл ковалентно
связывают с носителем, и методы, основанные на использовании непрямых
иммуносорбентов, когда к твердой фазе ковалентно пришивают связывающий
антитела реагент, и в результате образуется сорбент, способный связывать
комплекс антитела - органеллы (рис. 3.2). Однако прямые иммуносорбенты
редко бывают эффективны; как и при аффинной хроматографии, это
объясняется стерическими препятствиями, возникающими при присоединении к
ним крупных частиц. Большая эффективность непрямых сорбентов обусловлена
тем, что в этом случае имеется гибкая длинная "ножка", и стерические
ограничения уменьшаются. В качестве реагента, который пришивают к твердой
фазе, могут использоваться вторые антитела против иммуноглобулинов (поли-
или моноклональные) либо белок А из Staphylococcus aureus, который
связывается с Fc-доменом многих молекул иммуноглобулинов [63]. Иногда
роль твердофазной подложки играют фиксированные, инактивированные
нагреванием бактерии S. aureus [60, 61]. Методы с непрямыми сорбентами
позволяют стандартизовать процедуры и использовать одну твердую фазу для
приготовления препаратов различных органелл, применяя антитела разной
специфичности.
Выбор первых и вторых антител определяется их доступностью, хотя часто
учитываются и другие соображения. В принципе первое антитело должно
специфически взаимодействовать с соответствующей органеллой или нужным
фрагментом мембраны и обладать высокой авидностью. На практике
поликлональные антитела к изолированным органеллам редко бывают
специфичны из-за наличия загрязнений в препаратах органелл, а также
потому, что на мембранах различных органелл находятся одинаковые
антигены. Эти препятствия не всегда явтя-ются непреодолимыми. Например,
при выделении плазматических мембран реакцию с поликлональной
антисывороткой можно проводить с клетками до гомогенизации, так что
антителами -будет помечена только плазматическая мембрана [49]. Если
проводить эту процедуру на холоду, то эндоцитоза антител происходить не
будет [64], а кинетика связывания антител, для ко-
Иммунологические методы исследования мембран
129
торой характерна большая скорость ассоциации комплексов и малая скорость
их диссоциации, будет препятствовать перераспределению антител.
Поликлональные антитела против органелл обычно получают, используя
специфические антигены (белки, липиды или углеводы), или очищают эти
антитела с помощью аффинной хроматографии на соответствующих антигенах.
Иногда используют одновременно оба приема. При очистке значительно
повышается специфичность реагента и удаляются загрязняющие препарат
иммуноглобулины, которые мешают при использовании твердофазного
связывающего антитела сорбента. Несвязанный иммуноглобулин после реакции
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed