Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 56

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 191 >> Следующая

флуоресцентного клеточного сортера [20]; ее используют для выявления
антител против субпопуляций клеток или в тестах на цитотоксичность [25]
для определения компле-ментсвязываюших антител против антигенов клеточной
поверхности. Однако рассмотрение данного метода выходит за рамки этой
главы.
3, Иммуноблоттинг и анализ эпитопов
Возможности иммунологического анализа мембранных белков были существенно
расширены благодаря использованию электрофореза в полиакриламидных гелях
в присутствии ДСН с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные
фильтры для последующего выявления с помощью антител. Этот метод,
называемый иммуноблоттингом или вестерн-блот-тингом [26, 27], с успехом
заменил ранее разработанные методы иммунологического изучения белков,
разделенных с помощью электрофореза в геле, например встречный
иммуноэлектрофорез [28]. Его использование не требует диффузии антител в
гель или преципитации иммунных комплексов. Вместо этого белки элек-
трофоретически переносят и иммобилизуют на поверхности фильтра, и
используемые для анализа антитела имеют прямой доступ к ним. При этом
сохраняется такое же разрешение, как и при электрофорезе в ПААГ с ДСН, а
кроме того, повышается чувствительность: используя высокие титры антител,
удается выявлять менее 1 нг мембранных белков. Методические аспекты
124
Глава 3
Таблица 3.4. Иммуноблоттинг мембранных белков
А. Гель-электрофорез
Для электрофореза можно использовать самые разные гели и буферные
системы. Хорошие результаты при переносе на нитроцеллюлозу получаются на
самом деле при любой стандартной процедуре электрофореза в пластинах ПААГ
с ДСН при концентрации полиакриламида <12% (в/о, суммарный мономер).
Б. Перенос
1. Сразу после завершения электрофореза в ПААГ с ДСН формируют "сандвич"
для последующего переноса, состоящий из следующих слоев: пластина
перфорированной пластмассы
лист пористой резины (или материала Scotchbrite) два листа фильтровальной
бумаги ватман ЗММ пластина полиакриламидного геля
лист нитроцеллюлозы (Schleicher and Schull, 0,45 мкм, BA 85, подрезанный
по размеру пластины геля)
два листа фильтровальной бумаги ватман ЗММ
лист пористой резины (или материала Scotchbrite)
пластина перфорированной пластмассы.
2. Каждый слой сандвича смачивают в буфере для переноса и после наложения
на предыдущий слон прокатывают круглой стеклянной палочкой для удаления
пузырьков воздуха. Для некоторых мембранных белков лучше использовать
нитроцеллюлозные фильтры 0,22 мкм, а не 0,45 мкм.
3. Полностью сформированный сандвич помещают в пластмассовый аппарат для
электрофоретического переноса таким образом, чтобы гель располагался со
стороны катода, а лист нитроцеллюлозы - со стороны анода. Пригодные для
переноса аппараты с источником питания выпускают фирмы BioRad, Richmond,
СА, USA или Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA.
Емкости для переноса в этих приборах вмещают примерно 3 л буфера для
переноса1*.
4. Электрофоретический перенос проводят в течение ночи при комнатной
температуре при напряженности поля 6 В/см (расстояние измеряется между
электродами), т. е. при напряжении примерно 40 В для прибора фирмы
BioRad. Чтобы ускорить перенос, можно использовать аппарат для полусухого
перекоса (Sartorius GmbH).
В. Окрашивание, блокирование, промывание, инкубация с антителами и
проявление
I. Иммунопероксидазное окрашивание
Для визуализации полос, соответствующих стандартным белкам, можно
провести окрашивание н1 троцеллюлозного фильтра красителем понсо S [0,2%
(в/о) в 3%-ной (в/о) ТХУ; Serva] в течение 5 мин с последующим
промыванием водой. Положение полос следует отмечать, поскольку окраска
исчезает при последующих процедурах.
Фильтр промывают, проводят блокирование и проявляют (см. ниже), используя
PBS, содержащий 10% (о/о) лошадиной сыворотки и 0,1% (о/о) тритона Х-100
(буфер А), если не указано иное.
1. Фильтр промывают три раза по 15 мин в буфере А.
2. Инкубируют фильтр с первым антителом в течение 50 мин. Лучше всего
использовать IgG-фракцию при концентрации 1-20 мкг/мл.
3. Фильтр промывают три раза по 15 мин в буфере А.
4. Инкубируют фильтр с меченными пероксидазой хрена вторыми антителами в
течение 60 мин (используют антитела фирмы TAGO Inc., Burlingame, СА, USA,
в разведении I : 2000).
5. Промывают фильтр три раза по 15 мин в буфере А.
Иммунологические методы исследования мембран
125
Продолжение
6. Промывают фильтр два раза по 5 мин в PBS.
7. Обрабатывают фильтр 0,1 М трис-НС1, pH 7,4, содержащим З.З'-диамино-
бензидинтетрагидрохлорид в концентрации 0,5 мг/мл и I : 5000 Н202.
Объем буфера, используемого для промывания, зависит от размера фильтра
и может варьировать от 2 мл для одной дорожки геля до 25 мл для целого
фильтра.
Вместо лошадиной сыворотки в качестве блокирующих агентов можно применять
желатин (0,5%, в/о), гемоглобин или сухое молоко.
И. Проявление [1251] -белком А
1. Иодируют белок А или используют готовый препарат фирм Amersham Int-или
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed