Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
например
0.1°/о-ный тритон Х-100.
2. Инкубируют 50-100 мкл культуральной жидкости и 50 мкл буфера,
содержащего > 1 мг/мл БСА и соответствующий детергент, в лунках пластин,
сенсибилизированных антителами барана к иммуноглобулинам мыши (или крысы)
в течение 1 ч при комнатной температуре.
3. Пластины промывают два раза буфером, удаляя жидкость отсасыванием или
энергичным стряхиванием.
4. Добавляют 100 мкл пробы антигена, меченого и подготовленного в
соответствии с п. I. Инкубируют I-4 ч при комнатной температуре илн в
течение ночи при 4 °С.
5. Дважды промывают пластины, вырезают лунки и определяют связанную
радиоактивность на гамма-счетчике.
III. Радиоактивно меченный антиген п целлюлозный нмыуносорбент
1. Иодируют белок, включив <1 моля [1251] на I моль антигена. Разбавляют
до 200 000 имп./мин на I мл в соответствующем буфере, содержащем >1 мг/мл
БСА и подходящий для мембранного белка детергент. Разливают порциями по
100 мкл.
2. Инкуб груют со 100 мкл культуральной жидкости в течение I-4 ч прн
комнатной температуре илп в течение ночи при 4 °С.
3. Добавляют 50 мкл целлюлозного иммуносорбента со связанными бараньими
антителами к иммуноглобулинам мыши (крысы) с концентрацией белка 5 мг/мл
и инкубируют 1 ч при комнатной температуре.
4. Дважды промывают нммуносорбент 2 мл инкубационного буфера, осаждая его
центрифугированием. Сливают надосадочную жидкость н измеряют связанную с
иммуносорбентом радиоактивность. Радиоактивность контрольных образцов не
должна превышать 100 имп./мин. Более высокий уровень связывания в
контроле может указывать на агрегацию антигена; в этих случаях следует
попытаться использовать другие детергенты и/или более высокие
концентрации солен в буфере.
>) См. рзботу 1201.
плода коровы и обломки клеток, может оказывать неспецифическое действие
на компоненты системы. Например, при получении моноклональных антител к
5'-нуклеотидазе печени крыс мы обнаружили, что культуральная среда
оказывает ингибирующее
122
Глава 3
¦n02 действие на 5'-нуклеотидазу, хотя дело было в метаболизме
определяемого компонента системы [3Н]-аденозина под действием ферментов
цитозоля; этот эффект удалось устранить добавлением в субстратную смесь
избытка "холодного" (немеченого) аденозина (Bai-Iyes, 1979,
неопубликованные данные). Антитела, как оказывающие действие на данный
фермент, так и не оказывающие подобного действия, можно выявлять путем
удаления фермента из раствора с помощью комплекса
иммуносорбент/моноклональное антитело. Этот метод применим для любого
антигена, для выявления которого имеется специфический тест.
В качестве основного метода, альтернативного всем описанным выше,
используется следующий тест: твердофазный носитель, например пластину с
Рис. 3.1. Общая схема приготовления 96 лунками, сенсибилизируют
иммуносорбента на основе целлюло- антигеном, инкубируют СО срезы.
Детальное описание приведено в .. " .
Приложении II. д°и, в К0Т0Р0И выращивались
клетки, а затем добавляют меченые антитела к иммуноглобулинам мыши или
крысы или меченый белок А. Однако этот метод требует больших количеств
очищенного антигена. Кроме того, солюбилизированные мембранные антигены
могут плохо связываться с поверхностью лунок из-за присутствия
детергентов, блокирующих адсорбцию [20]. Например, обнаружено, что
плацентарная щелочная фосфатаза плохо связывается с поверхностью пластин,
и удовлетворительные результаты при тестировании были получены только
после предварительной сенсибилизации лунок кроличьими антителами против
плацентарной щелочной фосфа-тазы [24]. На пластины можно также
сорбировать клеточные мембраны, целые клетки и гликолипиды (табл. 3.3).
Тесты с применением целых клеток следует проводить при температуре ниже 4
СС, чтобы предотвратить эндоцитоз или захват антител мембранами.
порошак + целою.пазы \\ />
Иммунологические методы исследования мембран
123
Определяемый реагент может быть связан с ферментной системой
(пероксидазой, щелочной фосфатазой или (5-галактозида-зой) или помечен
радиоактивным изотопом. Иммуноферментные определения менее трудоемки, чем
радиоиммунные: в результате ферментативных реакций образуются окрашенные
продукты, количество которых легко измерить с помощью прибора типа
Multiscan, в то время как при радиоиммунных определениях приходится
вырезать каждую из лунок и по отдельности измерять их радиоактивность.
Однако присутствие эндогенной ферментативной активности в неочищенных
препаратах мембран или клеток может мешать иммуноферментному определению,
что ограничивает возможности применения тестов этого типа.
При радиоиммунных определениях в качестве меченого реагента можно
использовать иодированный белок А или иодированные антитела против Ig
мыши или крысы. Крысиный IgG, а также мышиные IgM и IgGi вообще не
реагируют с белком А или реагируют очень слабо [20], поэтому, вероятно,
лучше использовать меченные иодом антитела против иммуноглобулинов мыши
или крысы.
Существует также иммунофлуоресцентная методика с использованием
