Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 65

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 191 >> Следующая

зондов, было сконструировано несколько фаговых и плазмидных векторов
[119-124]. Чаще всего применяется фаговый вектор Xgtll [123-125], в
котором соответствующая кДНК встроена вблизи З'-конца структурного гена,
кодирующего р-галактозидазу. В результате рекомбинантные бактерии
продуцируют слитные белки, состоящие из большого фрагмента молекулы р-
галактозидазы и С-концевого сегмента пептида, кодируемого кДНК. Синтез
слитного белка можно индуцировать химически. Белки, высвобождающиеся
после лизиса клеток в составе бляшек, иммобилизуют на нитроцеллюлозном
фильтре, а затем проводят реакцию со специфическими антителами аналогично
тому, как это делается при иммуноблоттинге (разд. 3). Имеется
великолепное описание экспериментальных методов создания и скрининга
библиотек кДНК. в ^gtll [125]. Ценность вектора ^gtll при клонировании и
секвенировании кДНК, кодирующих минорные мембранные белки, иллюстрирует
использование его для определения структуры белка-переносчика глюкозы у
человека [126].
6.2. Плазмидные векторы
Для клонирования с успехом используется и плазмидный строго регулируемый
вектор рЕХ [124] (рис. 3.3). В этом случае кДНК также встраивается вблизи
З'-конца гена, кодирующего Р-талактозидазу; последний в свою очередь
располагается вслед за мощным промотором. У вектора рЕХ имеются три
разные модификации, что позволяет встраивать чужеродную ДНК в правильную
рамку считывания. Встраивание осуществляется в лин-керную
последовательность, содержащую нужный сайт рестрикции. Регуляция синтеза
слитных белков достигается благодаря введению плазмид в штамм Escherichia
coli, продуцирующий температурочувствительный репрессор; слитные белки
синтезируются только при повышении температуры до 42°С. Для амплификации
плазмиды перед повышением температуры клетки инкубируют при 30 °С.
Какой бы вектор ни использовался, необходимо иметь возможность
регулировать синтез слитного белка (химическая индукция для ^gtll или
температурная индукция для рЕХ) в тех случаях, когда он токсичен для
клеток. Плазмида рЕХ применялась для скрининга библиотек кДНК реже, чем
фаг Xgtll. Однако простота работы с плазмидной ДНК и возможность
получения слитных белков в количестве, составляющем 25% от суммарного
содержания клеточного белка, создают предпосылки
Иммунологические методы исследования мембран
143
для преимущественного использования именно плазмндного вектора. Эти
.преимущества особенно ощутимы, когда необходим вектор для экспрессии и
клонирования определенного фрагмента кДНК, позволяющего получить белок,
который можно использовать как иммуноген для приготовления антител
необходимой специфичности.
6.3. Скрининг
Процедура блоттинга колоний [127] с применением антител для скрининга
библиотек кДНК в рЕХ описана в табл. 3.8. Она сходна с процедурой
иммуноблоттинга (табл. 3.4). Вообще говоря, в качестве зонда при
скрининге по экспрессии можно ис-
N
Рис. 3.3. Вектор на основе плазмиды рЕХ. Такие векторы кодируют белки,
слитые с р-галактозидазой, - нерастворимые и образующие плотные тельца-
включения в клетках; они составляют до 25% суммарного белка Е. coli.
Подобные плазмиды содержат ген Р-лактамазы, атрг; мощный промотор PR;
гибридные гены cro-lacl - lacZ (Z); олигонуклеотидный линкер, содержащий
сайты клонирования (L), который в данном случае содержит короткую кДНК с
открытой рамкой считывания (зачерненный участок); олигонуклеотид,
содержащий стоп-кодоны для трансляции во всех рамках считывания (S) и
фрагменты терминации (Т) нз фага fd. Изображен также полипептид,
кодируемый гибридным геном и вставкой кДНК.
144
Глава 3
Таблица 3.8. Процедура блоттинга колоний для скрининга библиотек кДНК
в рЕХ
А. Выращивание и экспрессия
1. Заливают квадратные пластины размером 24x24 см 200 мл L-бульона,
содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1,6% (в/о) агара. Высушивают
пластины, выдерживая их в течение ночи без крышек в перевернутом
положении.
2. Культуру клеток клонотеки разбавляют до концентрации 104 клетка/мл в
L-бульоне, инкубируют 15 мин при 34 °С, а затем разбрызгивают по 1,5 мл
по поверхности пластин. Инкубируют в течение 20 ч при 30 °С.
3. Снимают крышку с пластины на 15 мин. Осторожно накладывают на пластину
сухой нитроцеллюлозный фильтр (Schleicher and Schull, 0,45 мкм).
Аккуратно прокатывают его и помечают положение, проколов отверстия
иголкой. Снимают фильтр с прикрепившимися колониями (1-5-104) и кладут
(колониями вверх) на два листа бумаги ватман ЗММ, смоченные L-бульоном с
ампициллином. Бумагу прокатывают, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Инкубируют 2 ч при 42 °С.
Б. Лизис и электрофорез
1. Фильтр помещают (колониями вверх) на два листа бумаги ватмаи ЗММ,
предварительно смоченные в 5%-ном ДСН и прокатанные. Прогревают в
закрытом контейнере, поместив его в обычный термостат (95 °С, 15 мин) или
в микроволновую печь (45 с, 600 Вт, затем 60 с, 200 Вт), до тех пор, пока
колонии не станут полупрозрачными.
2. Укладывают фильтр в сандвич для блоттинга (как это описано в табл. 3.4
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed