Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 64

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 58 59 60 61 62 63 < 64 > 65 66 67 68 69 70 .. 191 >> Следующая

Щелочная фосфатаза из хряща быка [97]
Ацетнлхолиновый рецептор Torpedo [98]
Рецептор фактора роста эпидермиса [84] Кальмодулинсвязывающий белок
грызунов [99]
Fc-рецептор грызунов [100]
Ацетилхолинэстеразы из электрического органа [101]
Рецептор фактора роста эпидермиса (денатурированный) [84]
Ренин подчелюстных желез мыши [103]
Урокиназа [104]
Лейкоцитарный интерферон [1051
Цитохром Р-450 [106]
Соматомедин-С/инсулинопо-добный фактор роста 1 [107]
140
Глава 3
Продолжение
Условия элюции Еыделяемые белки
9 М этандиол, 0,3 М NaCI Лейкоцитарный интерферон
0,1 М лимонная кислота, [108]
pH 2
В. Хаотропные I М NaCI, pH 7,4, детергент Антиген Н-2Кк [109]
ионы/высо- (0,1%)
кая ионная 2 М NaCI Никотиновые рецепторы аце-
сила тилхолина из мышц крысы
[110]
3 М NaCI Щелочная фосфатаза из пече-
ни [111]
2 М MgCl2, pH 7,4 С9-компонент комплемента че-
ловека [112]
3 М MgCls, pH 6,8 Тубулин-тирозин-лигаза [113]
4-8 М мочевина в PBS Специфичный для беременности
{Н-гликопротенн [114]
6 М мочевина Рецептор фактора роста эпи-
дермиса (денатурированный)
[85]
6 М гуанидинхлорнд, детер- Рецептор интерлейкина 2 [115]
гент (0,5%)
50 мМ ацетат натрня, 1 М ДНК-полимераза а [116]
КС1, pH 5.5
лочным pH обычно применяют буферы с высокой ионной силой и хаотропные
ионы. Иногда для получения антигена для таких целей, как анализ
аминокислотной последовательности, приходится использовать жесткие
условия элюции антигена, если при более мягких условиях его выход невелик
[84]. В отдельных случаях удается подобрать условия элюции специально для
данных антител. При выделении рецепторов для элюирования можно
использовать лиганд, с которым конкурируют моноклональные антитела [85,
86]. Например, при выделении Са2+-каль-модулинзависимой фосфодиэстеразы
циклических нуклеотидов было выбрано моноклональное антитело,
специфически связывающееся с комплексом кальмодулина с фосфодиэстеразой и
не связывающееся с каждым из компонентов комплекса по отдельности.
Связывание происходило в присутствии Са2+, и фермент элюировали, добавляя
2 мМ ЭГТА, который хелатировал Са2+ [83].
. Изучение свойств имеющихся моноклональных антител может быть весьма
полезным и плодотворным. Так, рецептор фактора роста эпидермиса из клеток
А431 содержит углеводную структуру антигена группы крови А; было
показано, что моноклональные антитела, полученные к этому рецептору,
реагируют
Иммунологические методы исследования мембран
141
с указанным антигеном. Для элюции активного рецептора можно использовать
N-ацетилгалактозамин в концентрации 0.25М, который конкурирует за
связывание с антителами [87].
S.2.3. Выбор антител и условий элюции
Если для иммунной очистки можно использовать несколько разных антител, то
лучше выбрать антитела с низкой аффинностью. Для проведения
предварительных экспериментов по изучению различных условий элюции можно
использовать целлюлозный иммуносорбент с пришитыми к нему бараньими
антителами к IgG мыши (50 мкл с содержанием антител 5 мг/мл), с которым
связывают моноклональные антитела из культуральной или асцитной жидкости
в разведении 10~3 (100 мкл) и антиген. Если определение биологической
активности затруднено, можно воспользоваться радиоактивно меченным
антигеном и следить за появлением метки в элюате. Условия, при которых
удается получить хорошие результаты, применяют затем для элюции
биологически активного антигена. После элюции рекомендуется провести
гель-фильтрацию, чтобы освободиться от агрегированного или
денатурированного антигена или следовых количеств несвязанных
моноклональных антител.
6. Использование антител для отбора i
комплементарных ДНК, кодирующих мембранные белки
Чтобы до конца понять структурные свойства белка, необходимо знать его
первичную структуру. Однако минорные мембранные белки очень трудно
.получить в чистом виде в количестве, достаточном для определения их
аминокислотной последовательности обычными методами белковой химии.
Альтернативный подход к решению этой проблемы может состоять в секвениро-
ванин комплементарной ДНК (кДНК), кодирующей нужный белок. А для этого в
свою очередь необходимы зонды, позволяющие провести детекцию
специфической ДНК- Если известна первичная структура коротких фрагментов
белка, то можно синтезировать олигонуклеотидные зонды для скрининга кДНК,
а критерии пригодности для таких зондов хорошо известны [117]. Когда нет
никакой информации о первичной структуре, создание таких зондов
становится невозможным, а поскольку для большинства минорных мембранных
белков не удается получить в большом количестве соответствующую мРНК, не
может быть проведен и скрининг клонов кДНК методом гибридно-селективной
трансляции [118]. Весьма элегантный подход к решению проблем, связанных
со скринингом, основан на использовании специфических антител для
идентификации клонов кДНК.
142
Глава 3
6.1. Фаговые векторы
Для получения антител, которые можно было бы использовать в качестве
Предыдущая << 1 .. 58 59 60 61 62 63 < 64 > 65 66 67 68 69 70 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed