Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 57

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 191 >> Следующая

New England Nuclear.
2. Переносят белки на нитроцеллюлозные фильтры и окрашивают в течение 1
мин в 0,3%-ном амидочерном, растворенном в смеси вода : метанол: уксусная
кислота (50/40/10). Промывают фильтры в PBS.
3. Инкубируют фильтры с антисывороткой или антителами в PBS, содержащем I
% БСА, в течение 60 мин при 37 °С или в течение ночи при 4 °С. Разведение
антител зависит от титра (от 1 : 20 до 1 : 1000).
4. Промывают фильтры три раза PBS.
5. Инкубируют фильтры с [1251]-белком А (1-10(r) имп./мин) в течение 45 мин
при комнатной температуре.
6. Тщательно промывают фильтры в PBS, содержащем 0,1% тритона Х-100,
высушивают и экспонируют с пленкой KODAR-X-OMAT AR.
*) Буфер для переноса содержит 12 г глицина и 2.5 г трис-основаиия на 1
л. Для улучшения переноса можно добавить метаиол, но это не обязательно.
и применение иммуноблоттинга белков рассмотрены в обзорах [29-33]. В
большинстве лабораторий разработаны собственные приемы
электрофоретического переноса, подходы к выбору фильтров, белковых
блокирующих реагентов, условий инкубации с антителами, а также методов
регистрации (с использованием радиоактивных изотопов для ферментов). Тем
не менее некоторые варианты методик применяются наиболее широко; они и
представлены в табл. 3.4.
Разработаны также варианты основного метода иммуноблоттинга,
предназначенные для особых целей. Если возникают затруднения при
установлении природы белкового антигена в смеси белков после разделения в
ПААГ с ДСН или после двумерного электрофореза, то гель можно
зафиксировать и окрасить кумасси синим перед электрофоретическим
переносом белков на нитроцеллюлозный фильтр. Фиксированные и окрашенные
белки выходят из геля медленно, и для их полного переноса нужно
проинкубировать гель в течение 2 ч при комнатной температуре в буфере,
содержащем ДСН, перед тем, как осуществлять перенос [34]. После переноса
на фильтре появляются голубые полосы; инкубация с первым антителом, а
затем с меченным пероксидазой вторым антителом и последующая обработка
ди-аминобензидином приводят к появлению коричневой окраски в
126
Глава 3
том месте, где были голубые полосы; она хорошо видна, если смотреть через
синий фильтр.
Еще один метод анализа мембранных белков - это использование
иммобилизованных на фильтре белков для иммуноаф-финной очистки антител
[35]. С помощью этого метода можно определить, содержат ли две белковые
полосы в геле одинаковые эпитопы. Для этого нужно элюировать антитела,
связанные с одной белковой полосой, и провести реакцию этих антител с
материалом второй полосы. Таким образом можно идентифицировать пептиды,
образующиеся при протеолизе более крупных белков, а частности в ходе
выделения мембран [2].
При иммуноблоттинге можно использовать как поликлональные, так и
моноклональные антитела. Однако в последнем случае иногда возникают
определенные трудности. Так, эпитопы могут необратимо разрушаться при
подготовке образцов к электрофорезу в ПААГ (например, при восстановлении
[36]). Считается, что белки связываются с нитроцеллюлозой благодаря
гидрофобным взаимодействиям [37], и обычно предполагается, что метод
иммуноблоттинга позволяет наружным, более гидрофильным участкам белковых
молекул принимать свою нормальную эпитопную конформацию. Фактически белки
могут восстанавливать свои функциональные свойства при иммуноблоттинге,
как это было показано для З'-фосфодиэстеразы 2'-3'-циклических
нуклеотидов [38], связывания бунгаротоксина ацетилхолиновым рецептором
[39], .иммунореактивности антител [40] и связывания Са2+ различными
белками [41]. Способностью к восстановлению правильной антигенной
конформации при блоттинге обладают не только интактные белки, но и
некоторые фрагменты бечко-вых молекул, полученные при протеолитическом
или химическом расщеплении. Это позволило картировать эпитопы с помощью
иммуноблоттинга при взаимодействии и моноклональных, и поликлональных
антител со многими белками [42]. Метод дает особенно ценную информацию в
том случае, если используются антитела, способные модифицировать функции
белков с известной первичной последовательностью, поскольку это позволяет
высказать определенные предположения о топографии белков (например, в
составе мембран) и об их биологической активности [43].
Разработаны также методы иммуноблоттинга гликолипидных антигенов. В этом
случае гликолипиды разделяют с помощью ТСХ, а затем переносят на
нитроцеллюлозу [44]. Гликолипид-ные антигены можно выявлять и
непосредственно на пластинах после иммобилизации с использованием
полиизобутилметакри-лата [45, 46].
Иммунологические методы исследования мембран
127
Таблица 3.5. Иммуноаффинная очистка субклеточных фракций
Эффектив-
Органелла Тип клеток/ткаии ность адсорбции1) Ссылка
Плазматические мембраны Адипоцпты, гепато- 8,8 [49, 53, 54]
циты 14,6
Домены плазматических мем- Клетки печени, по- [55, 56]
бран чек 31
Везикулы с правильной или об- Эритроциты [56]
ратной (вывернутые) конфи-
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed