Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 59

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 191 >> Следующая

с первыми антителами обычно уда-
Рис. 3.2. Прямой (А) и непрямой (?) иммуноаффинный метод выделения
клеточных органелл и мембран. В первом случае проводят реакцию между
гомо-генатом или частично очищенными субклеточными фракциями и антителами
против органелл, иммобилизованными иа твердом носителе. Во втором случае
проводят реакцию между свободными антителами против органелл и гомоге-
натом (или соответствующей фракцией), не связавшиеся антитела отмывают и
выделяют органеллы с помощью иммуносорбента, связывающего антитела. На
рис. Б этот иммуносорбент показан в виде иммобилизованных на твердой фазе
антител к иммуноглобулинам, способных реагировать с антигенным сайтом
(черный квадратик), расположенным в Fc-области антител против органеллы.
Как видно из рисувка, и в первом и во втором случае будут выделены только
такие мембраны и органеллы, в составе которых антиген имеет правильную
топографию; структуры, содержащие другие антигены нли имею-
щие вывернутую ориентацию, останутся несвязанными.
9-1488
130
Глава 3
ляют отмыванием, но без этой процедуры можно обойтись, если использовать
аффинно очищенные антитела в нужном разведении. Применение аффинно
очищенных антител против органелл позволяет проводить очистку в один
прием, поскольку эти антитела можно заранее связать с анти-
иммуноглобулиновым сорбентом перед инкубацией с клеточным гомогенатом или
с частично очищенной субклеточной фракцией [58].
Поликлональные антитела против эндогенного компонента данной органеллы
можно использовать и в другом варианте, а именно - изменить антигенную
структуру выделяемой органеллы. Так, в плазматические мембраны для этой
цели включили вирусный белковый антиген [56], а затем выделили их,
используя реакцию связывания с антителами к вирусному белку и с
иммуносорбентом против иммуноглобулинов класса G. Вирусный белок
включается в мембраны при простом понижении pH внешней среды, а затем
диффундирует в плоскости фосфо-липидного бислоя. Таким образом было
показано, что иммуно-аффинное выделение мембран зависит от плотности
антигенов, которая должна быть больше 50 молекул на 1 мкм2. Вероятно, эта
закономерность носит общин характер [54, 56], и ее нужно учитывать при
выборе антигена для получения антител против данной органеллы. Это
позволяет также выделять мембраны и органеллы, обогащенные антигеном,
который в других компонентах клетки присутствует в меньших концентрациях.
Вероятно, для субклеточного фракционирования можно использовать и
высокоаффинные моноклональные антитела. Каждое моноклональное антитело
способно реагировать только с одной антигенной детерминантой, и как это
отражается на их применимости для иммуноаффиннон хроматографии - неясно.
Однако можно использовать не одно антитело, а смесь моноклональных
антител разной специфичности. Более серьезная проблема, которая возникает
при применении моноклональных антител, связана с методикой скрининга для
выбора секретирую-щих антитела гибридом. Для подтверждения специфичности
данного антитела к антигену определенной органеллы может понадобиться
использовать иммунофлуоресцентную или даже иммуноэлектронную микроскопию,
а это сопряжено с большими затратами времени. Впрочем, достаточно
эффективными могут оказаться и более простые тесты на связывание с
клеточными органеллами и мембранными фракциями, представленные в табл.
3.3. В будущем антитела с заранее заданной специфичностью для
фракционирования субклеточных компонентов можно будет получать, используя
синтетические полипептидные эпитопы или применяя методы молекулярного
клонирования.
Антитела против иммуноглобулинов, пришиваемые к твердофазному носителю
для последующего непрямого иммуноаффин-
Иммунологические методы исследования мембран
131
ного выделения, должны обладать высокой авидностью, реагировать с
иммуноглобулинами разного типа и быть доступными в больших количествах.
Для этих целей особенно подходят определенные моноклональные антитела,
поскольку при наличии единственной линии гибридом могут быть получены
практически неограниченные количества антител. Для некоторых видов первых
поликлональных антител (например, бараньих или кроличьих) имеются
соответствующие мышиные моноклональные вторые антитела, а если в качестве
первых антител применяются мышиные моноклональные антитела, то для
связывания с твердофазным носителем можно использовать крысиные
моноклональные антитела против IgG мыши. Белок А из S. aureus связывается
с Fc-фрагментом иммуноглобулинов, что позволяет изготавливать на его
основе иммуносорбенты, обеспечивающие разделение в одну стадию и
ориентированное расположение иммуноглобулинов; для изготовления сорбентов
проводят реакцию с аффинно очищенными поликлональными антителами и
последующую стабилизацию химическими сшивающими реагентами 165).
Для любой методики иммуноаффинного выделения клеточных органелл или
фрагментов мембран время взаимодействия и кривые "доза - ответ" для
первых антител и иммуносорбента должны определяться экспериментально, с
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed