Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 63

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 57 58 59 60 61 62 < 63 > 64 65 66 67 68 69 .. 191 >> Следующая

необходимо, чтобы концентрация детергента составляла 2% (в/о) [78].
Имеются сообщения, что под действием детергентов может разрушаться
комплекс антиген - антитело [79-81]. В этих случаях для солюбилизации и
иммуноаффинной очистки можно использовать разные детергенты. Смену
детергента можно осуществить с помощью гель-фильтрации.
5.2. Очистка мебранных белков на иммуносорбентах
Несмотря на то что использование поликлональных антител для очистки
мембранных белков привело к определенным успехам [82], иммуноаффинные
методы выделения получили широкое распространение только с появлением
моноклональных антител. В большинстве работ очищенные моноклональные
антитела связывали с носителем, используя в качестве сорбента
активированную с помощью CNBr сефарозу 4В или аффигель, поставляемые
фирмами Pharmacia и BioRad соответственно. Обычно с этими носителями
удается связять 1-10 мг белка на 1 мл геля. Антитела связывали также с
носителем ультрогель АсА34 (полимер агарозы и акриламида) с помощью
глутарово-го альдегида [83]. Альтернативный подход состоит в связывании
антител с модифицированной целлюлозой ([68]; табл. 3.2); получающийся
сорбент обладает высокой емкостью, но плохо пропускает элюирующий
раствор. Поэтому подобные сорбенты на основе целлюлозы используют для
очистки в объеме, а не на колонках.
138
Глава 3
5.2.1. Нанесение антигена на иммуносорбент на основе моноклональных
антител
Нанесение антигена на иммуносорбент можно проводить при 4 °С или при
комнатной температуре. При комнатной температуре связывание идет быстрее,
но эти условия непригодны, если антиген нестабилен или подвержен
протеолизу. Антиген можно наносить на колонки с сефарозой при скорости
потока до 20 объемов колонки в час. Проходящий через колонку материал
следует тестировать на антигенную активность, и если окажется, что
количество несвязавшегося антигена значительно, то необходимо проверить
емкость колонки или скорость потока; впрочем, постоянное присутствие
некоторого количества несвязанного антигена может быть обусловлено
гетерогенностью этого антигена. Инкубацию антигена с целлюлозным
иммуносорбентом следует проводить при постоянном перемешивании в течение
30-60 мин при 20 °С или в течение А ч при 4 °С. Аликвоту смеси следует
отцентрифугировать (2 мин при 9000 g в настольной центрифуге фирмы
"Эппендорф" или аналогичной), отобрать супернатант и измерить степень
связывания антигена иммуносорбентом.
В обоих случаях при использовании колонки и при взаимодействии в объеме
необходимо тщательно промывать иммуносорбент после реакции с антигеном.
Можно предварительно промыть сорбент элюирующим буфером перед
уравновешиванием в буфере для нанесения, а также провести после реакции с
антигеном по меньшей мере одно промывание солевым концентрированным
раствором, не вымывающим антиген с поверхности сорбента.
5.2.2. Элюция антигена с иммуносорбента
Для разрушения связи антиген - антитело используют буферные растворы с
высоким или низким значением pH, хаотроп-ные ионы/концентрированные
солевые растворы и конкурирующие лиганды.
Многие мембранные белки при очистке элюируют при щелочных pH. Для этих
целей широко используют диэтиламин (50 мМ, pH 11,2-11,5) (табл. 3.7).
Важно быстро нейтрализовать элюированный фермент. Для этого, например,
фракции объемом 1 мл с колонки можно собирать в пробирки, содержащие по
0,1 мл 2М трис-НС1, pH 6,8. Если используется целлюлоза, можно
фильтровать элюат через стерилизующий фильтр для очистки от микрочастиц.
Элюат можно пропускать через маленькую колонку для гель-фильтрации.
Буферы с кислым pH используются реже, и в качестве альтернативы растворам
с ще-
Иммунологические методы исследования мембран
139
Таблица 3.7. Условия элюции белков с иммуносорбента на основе монокло-
нальных антител
Условия ЭЛЮЦИИ
Выделяемые белки
А. Высокие pH
Б. Низкие pH
50 мМ диэтиламин, pH 11,2- 11,5
± Детергент, 0,1-0,5%
+0,14 М NaCI
100 мМ диэтиламин, pH 11,5
±Детергент, 0,2-0,5%
0,6 М 2-амино-2-метнл-1-пропанол, pH 10,2 0,2 М глиции/ОН, pH 10 0,5 М
NaCI, 1%-ный холат натрня 20 мМ лизин/ОН, pH 11 0,1%-ный тритон Х-100 100
мМ триэтиламин, pH 10
100 мМ триэтнламин, pH 11,5 (0,5%-ный дезоксихолат натрия)
0,05-0,1 М глицин-HCl, pH
2.5-2,8 Детергент, 0,1-0,2%
+0,5 М NaCI
0,2 М уксусная кислота, pH
2.5-3
0,15-0,3 М NaCI, детергент (0,1%)
PBS, pH 3,2 5%-ный глице-рол 0,1 % -ный эмульген 911 0,2 М ацетат
аммония, pH 3
Гликопротеин Thy-1 из мозга крыс [88]
Эпоксидгидролаза [80]
Рецептор Т-клеточного антигена [90]
Антигены HLA-A2, HLA-B7 [77] Антиген W3/13 тимоцитов крысы [91]
Антиген ОХ2 крысы [92]
Общий антиген, ассоциированный с острым лимфолейкозом Рецептор
трансферрина [65] Мембранный антиген вируса Эпштейна-Барр [93] 5'-
Нуклеотидаза из печени крысы [78]
Щелочная фосфатаза из печени человека [23] СЗЬ-Инактиватор человека [94]
Поверхностный гликопротеин клеток грызунов [95] Мембранный белок
Toxoplasma gondii [96]
Предыдущая << 1 .. 57 58 59 60 61 62 < 63 > 64 65 66 67 68 69 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed