Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 71

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 191 >> Следующая

водорастворимых примесей не имеет существенного значения, то после
первоначального разделения фаз и удаления верхней фазы нет необходимости
промывать экстракт. То небольшое количество верхней фазы, которое
остается после ее удаления, можно диспергировать в нижней фазе, добавив
несколько капель метанола.
2.3. Подкисление растворителя для липидной экстракции
Кислые фосфолипиды, свободные жирные кислоты и поли-фосфоинозитиды не
удается извлечь полностью смесью хлороформ/метанол. Для полной экстракции
этих липидов к смеси растворителей необходимо добавить НС1 до
концентрации 0,25%. В принципе такую систему можно использовать для
экстракции во многих случаях. Однако следует иметь в виду, что при этом
происходит кислотный гидролиз плазмалогенов, и если предстоит исследовать
именно эти липиды, то кислоту нельзя добавлять в растворитель,
используемый для их экстракции.
2.4. Экстракция больших объемов мембранной суспензии
Большие объемы водных суспензий мембран лучше всего экстрагировать,
используя методику, описанную в работе [4].
1. К 8 мл мембранной суспензии добавляют 30 объемов
154
Глава 4
смеси хлороформ/метанол (1 :2) и перемешивают до образования гомогенной
суспензии. Если при этом образуется объемный осадок, его следует удалить
фильтрованием или центрифугированием. Если же осадка мало, то его можно
удалить позже при отделении верхней фазы.
2. Добавляют 10 мл хлороформа и 10 мл воды, перемешивают и либо оставляют
смесь до разделения фаз, либо центрифугируют, чтобы ускорить разделение.
3. Удаляют с помощью пастеровской пипетки верхнюю фазу вместе с остатком
денатурированных белков, находящихся на границе раздела фаз. Нижняя фаза
содержит все липиды, кроме ганглиозидов.
2.5. Удаление растворителя из липидного экстракта
Небольшие объемы хлороформа лучше всего удалить из липидного экстракта в
потоке азота в вытяжном шкафу. Для этой цели очень хорошо подходит
концентратор образцов типа Techne SC3 (рис. 4.1). Липидные экстракты
заливают в подходящие по размеру стеклянные сосуды (пробирки или
флаконы), которые помещают в термостатируемый нагревательный блок. Поток
азота или сжатого воздуха направляют через подходящим образом
расположенные иглы на поверхность каждого экстракта. Используя этот
аппарат, можно одновременно концентрировать или высушивать 48 образцов,
каждый из которых содержит до 10 мл хлороформа. Можно собрать подобную
установку, использовав плоский нагреватель, нагревательный блок или
водяную баню и направляя азот в каждую пробирку или флакончик через
систему пастеровских пипеток, подсоединенных через общую разводку к
баллону с газом. С помощью такого устройства можно быстро упарить
растворитель; однако образцы не следует нагревать выше 40-50 °С, если
затем предполагается дальнейшее исследование липидов.
Большие объемы хлороформа лучше всего удалять из липидных экстрактов с
помощью имеющихся в продаже роторных испарителей. Эта операция обычно
занимает много времени, особенно если предстоит упаривать большое число
образцов. На рис. 4.2 показана другая система, которую можно использовать
для концентрирования экстрактов объемом около 100 мл. Это простое
устройство легко изготовить в любой стеклодувной мастерской.
1. Переносят липидный экстракт в грушевидную колбу с шлифовым
соединением.
2. Подсоединяют ее к первой ловушке, которая связана с конической колбой,
подключенной к вакуумному водоструйно-
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
155
му насосу. Подсоединение следует проводить при работающем насосе.
3. Осторожно перемешивая содержимое колбы вращательными движениями,
нагревают ее в водяной бане для испарения растворителя. При бурном
вскипании раствора весь липидный экстракт, попавший в первую ловушку,
стекает обратно в грушевидную колбу, тогда как пары растворителя попадают
в охлаждаемую коническую колбу и конденсируются.
Рис. 4.1. Прибор для концентрирования образцов типа Techne SC3. Он
состоит из нагревательного блока со сменными насадками, предназначенными
для пробирок и флаконов разного размера. Растворитель испаряют в потоке
азота, направляемом через иглы, число и положение которых можно
регулировать в зависимости от количества образцов.
156
Глава 4
4. Отсоединяют грушевидную колбу при подключенном вакууме, чтобы
предотвратить засасывание в нее воды из насоса.
Необходимо принять меры предосторожности на случай разрыва колбы под
вакуумом. Используя это устройство, можно быстро упарить досуха в
грушевидных колбах большое число липидных экстрактов. Экстракт затем
растворяют в небольшом объеме хлороформа или смеси хлороформ/метанол
(1:1) и хранят до последующего исследования в колбе или переносят в
другой сосуд.
3. Разделение липидов по классам
Для разделения и анализа липидов предложено много методов, включая
фракционирование по растворимости в различных растворителях, колоночную
хроматографию на силикагеле и оксиде алюминия, тонкослойную хроматографию
(ТСХ) и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Здесь нет
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed