Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
адсорбента. Перед нанесением пластинку покрывают пластиковым экраном,
оставляя открытым только ее нижний край, и наносят образцы в виде
поперечной линии у основания каждой размеченной полоски. Для этого
пользуются гамильто-новским шприцем, микропнпеткой с тонким наконечником
или стеклянным капилляром (рис. 4.3). При необходимости липидный раствор
можно нанести повторно вдоль той же линии, предварительно подсушив первый
слой. Следует быть очень осторожным и не повредить слой адсорбента; в
поврежденном слое нарушается равномерность движения растворителя вверх по
пластинке и ухудшается качество разделения. Некоторые исследователи
наносят липидный экстракт в виде перекрываю-
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
15"
щихся небольших пятен, а не в виде одной линии. Однако с приобретением
необходимого навыка удается нанести липидный раствор одной тонкой линией
с помощью шприца или пипетки. Количество липида, наносимого на тонкий
слой стандартной толщины (0,25 мм), меняется от опыта к опыту. Для
ориентировки скажем, что фосфолипидную фракцию микро-сомных липидов можно
удовлетворительно разделить, когда на полосу адсорбента шириной около 5
см наносят до 2 мг липида (~2 мкмоля). Фосфатидилхолин, на долю которого
приходится 50% микросомных липидов, концентрируется в этих условиях в
виде интенсивной полосы, четко отделяясь от других фосфолипидов,
присутствующих в образце.
1. Использование стандартов. Если использовать пластинки одного типа и
проводить разделение в одной и той же системе растворителей, то
относительное положение липидов будет воспроизводиться достаточно хорошо,
однако значения будут несколько различаться для разных пластинок. Поэтому
одновременно с липидным экстрактом на каждую пластинку следует нанести
чистые образцы всех исследуемых липидов. При этом обычно наносят около 10
мкг каждого липида в 10 мкл растворителя в виде пятен, находящихся по
краям хроматографической пластинки (рис. 4.3).
2. Разделение липидов (проявление тонкослойных пластинок). Прежде чем
начинать разделение, необходимо убедиться, что растворитель полностью
испарился из нанесенных образцов. Поскольку липиды в сухом состоянии
нестабильны из-за их чувствительности к окислению, разделение следует
начинать сразу же после испарения растворителя.
Рис. 4.3. Нанесение образцов на пластинки для ТСХ. В верхней части
рисунка показана пластинка для ТСХ, покровная пластинка и мнкропипетка,
используемая для нанесения образца. В нижней части показан типичный вид
пластинки до разделения Стандарты наносят в виде пятен на крайние дорожки
адсорбента, осторожно отмеченные мягким карандашом, а липидный экстракт -
в виде полос на внутренние дорожки. Возможны различные варианты нанесения
образцов в зависимости от числа стандартов и подлежащих, разделению
образцов.
160
Глава 4
В зависимости от размера хроматографической камеры берут 80-150 мл
системы растворителей (см. ниже), выжидают, пока в камере не установится
равновесие, и помещают в ¦нее пластинки. Уровень растворителя должен быть
приблизительно на 1 см ниже уровня нанесенных образцов. Разделение
заканчивают, когда фронт растворителя доходит до уровня на 1-2 см ниже
верхнего края пластины. Пластинку вынимают из камеры, осторожно отмечают
карандашом фронт растворителя и высушивают в вытяжном шкафу.
3.1.3. Двумерная ТСХ
При разделении смеси липидов сложного состава (например, при отделении
лизофосфолипидов от исходных негидролизованных липидов) может возникнуть
необходимость в использовании двух систем растворителей и проведении
двумерной хроматографии.
1. Накосят образец в одном углу пластинки и проводят разделение в первой
системе растворителей, так чтобы пятна расположились вдоль одного края
пластинки.
2. Высушивают пластинку, поворачивают ее на 90°, так чтобы пятна
располагались внизу, и проводят разделение во второй системе
растворителей (рис. 4.4). Образцы стандартных .липидов не удается
элюировать в двух направлениях одновременно с анализируемой липидной
смесью. Но относительное положение различных липидов можно определить,
"прогоняя" •стандартные образцы по краям пластинки в каждой системе
растворителей (рис. 4.4).
3.2. Системы растворителей для разделения мембранных липидов
В мембранах могут содержаться неполярные липиды (хо-лестерол, эфиры
холестерола, три-, ди- и моноацилглицеролы) и полярные (фосфолипиды и
гликолипиды). Неполярные липиды являются минорными компонентами мембран;
исключение составляет холестерол. Часто неполярные липиды, обнаруживаемые
в мембранной фракции, не входят в состав мембран, а захватываются
мембранными везикулами при выделении мембран. Например, триацилглицеролы,
секретируемые печенью, захватываются цистернами эндоплазматического
ретикулума и аппарата Гольджи (гл. 1). Ни в одной системе растворителей
нельзя разделить все классы липидов. Обычно выбирают такую систему,
которая удовлетворяет задачам исследования, а если необходим полный
