Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
водяной бане. Охлаждают пробирки до комнатной температуры и измеряют
оптическую плотность при 830 нм, используя в качестве контроля образец,
приготовленный точно таким же образом, но не содержащий фосфата.
8. Используя стандартные растворы, содержащие фосфат в количестве 0-2,0
мкмоля, строят калибровочную кривую; при этом стандартные образцы не
сжигают и не центрифугируют. Количество фосфолипида в мкмолях,
содержавшееся в сожженном образце, можно определить с помощью этой
калибровочной кривой прямо по результатам измерений оптической плотности.
Зависимость является линейной до 2,0 мкмолей фосфата; чувствительность
метода достигает 0,05 мкмоля.
Чтобы определить количество фосфора в суммарном липидном экстракте или во
фракциях, элюированных с ТСХ-пластинок, следует отобрать пробу липидного
раствора, испа-
174
Глава 4
рнть растворитель в потоке азота, добавить хлорную кислоту, провести
сожжение и определить количество фосфолипида, исключив стадию
центрифугирования.
Перед определением фосфолипидов описанным выше методом имеет смысл
отобрать пробу силикагеля с используемых тонкослойных пластинок и
определить в ней содержание фосфата. Имейте в виду, что пластинки фирмы
Merck с силикагелем 60 F254 не содержат фосфата, тогда как пластинки той
же фирмы типа силикагель/кизельгур F254 характеризуются высоким
содержанием фосфата и их нельзя использовать в данном анализе.
4.3. Определение сложных эфиров
Сложноэфирные группы в три-, ди- и моноацнлглнцеролах, эфирах холестерола
илн фосфолипидах определяют по методу Снайдера и Стефенса [19].
Реагенты
а. Растворяют 5 г Fe(CI04)3-6H20 в смеси 10 мл 70%-ной хлорной кислоты и
10 мл дистиллированной воды. Разбавляют раствор холодным абсолютным
этанолом до 100 мл и хранят его при 4°С. Раствор не портится в течение
нескольких месяцев.
б. Непосредственно перед использованием смешивают 4 мл реагента с 3 мл
70%-ной хлорной кислоты и разбавляют до 100 мл холодным абсолютным
этанолом.
в. Растворяют 2 г гидрохлоридгндроксиламнна в небольшом объеме воды и
разбавляют до 50 мл абсолютным этанолом.
г. Растворяют 4 г NaOH в небольшом объеме дистиллированной воды и
разбавляют до 50 мл абсолютным этанолом.
д. Смешивают равные объемы реагентов в) и г). Отфильтровывают смесь и
используют фильтрат как реагент д). Реагенты в), г) и е) следует готовить
прямо перед использованием.
е. Для приготовления стандартного раствора сложного эфира в хлороформе (1
мкмоль/млЗ можно использовать трно-леоилглицерол или метилстеарат.
Учтите, что триацилглицерол, используемый как стандарт, имеет три
сложноэфнрные группы.
Методика определения
1. Растворяют элюированные липиды в хлороформе и отбирают пипеткой пробы
в пробирки. Полностью испаряют растворитель в потоке азота.
2. Добавляют 1 мл реагента д). Прикрывают пробирку шариком и прогревают
смесь при 65 °С в течение 2 мин в термостате или в водяной бане.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
175
3. Охлаждают пробирки и добавляют 3 мл реагента б). Перемешивают и
оставляют на 30 мин до появления розовато-лиловой окраски.
4. Измеряют оптическую плотность при 530 нм относительно контрольного
образца.
5. Строят калибровочную кривую, используя стандартные растворы,
содержащие сложный эфир в количестве 0- 10 мкмолей. Количество три-, ди-
и моноацилглицеролов можно определять прямо по калибровочной кривой.
Чтобы получить количество этих липидов в микромолях, надо разделить
найденное количество микромолей сложного эфира на 3, 2 и 1
соответственно.
Чувствительность метода составляет около 0,05 мкмоля в расчете на
сложноэфирную группу. Его можно использовать только после разделения
липидов на фракции, поскольку анализ основан на определении сложноэфирных
групп, а не отдельных классов веществ.
4.4. Определение холестерола и его эфиров
Холестерол и его эфиры можно определять как в суммарном липидном
экстракте, так и в отдельных его фракциях. Прн анализе
нефракционированных липидных экстрактов сначала определяют общий
холестерол (т. е. свободный и этерифициро-ванный), а затем осаждают
свободный холестерол дигитони-ном. Этерифицированный холестерол
определяют по разности между количеством общего и свободного холестерола.
Реагенты
а. Растворяют 2,5 г FeCl3-6H20 в 85%-ной ортофосфорной кислоте, так
чтобы конечный объем составил 100 мл. Хранят этот раствор в темной посуде
при комнатной температуре. При образовании осадка раствор следует
выбросить.
6. Разбавляют 4 мл реагента а) концентрированной H2SO4 до объема 50 мл.
Смесь охлаждают н хранят при комнатной температуре. Если раствор
помутнеет, его следует выбросить
в. Растворяют 1 г дигитонина в 50 мл 95%-ного этанола. Доливают до 100 мл
водой. Раствор можно хранить в темной посуде до 6 месяцев.
г. Готовят стандартный раствор, растворив 100 мг холестерола в 100 мл
ледяной уксусной кислоты. При анализе разбавляют этот раствор в 10 раз
так, что концентрация холестерола становится равной 0,01%, или 0,258 мМ.
