Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
мкмолей фосфата, образующегося за 1 мин.
Латентность маннозо-6-фосфатазы равна
Активность в присутствии - Активность без таурохолата
таурохолата___________________________________________ 100 (%)
Активность в присутствии таурохолата
Доля интактных микросомных везикул превышает 90%. Она должна сохраняться
в процессе обработки мембран зондами, действующими на фосфолипиды.
5.2.3. Латентность этанолацилтрансферазы
Этанолацилтрансфераза катализирует перенос пальмитата от пальмитонл-СоА к
этанолу. В микросомных везикулах этот фермент является латентным и более
широко распространен в тканях, чем глюкозо-6-фосфатаза, которая
обнаружена в больших количествах только в эндоплазматическом ретикулуме
печени [26]. Поэтому этанолацилтрансфераза расширяет возможности контроля
за целостностью микросомных мембран и ее можно использовать в случае
микросом, не содержащих маннозо-6-фосфатазы.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
181
Определение активности этанолацилтрансферазы
Реагенты
а. Буфер 0,175 М трис-НС1, pH 7,0, содержащий 1 мг/мл
альбумина и 8 мМ MgCK. ,
б. 400 мкМ [l4CJ- или [3Н]-пальмитоил-СоА (100 мкКи/ мкмоль) в буфере а).
в. Абсолютный этанол.
г. 1%-ный дезоксихолат в буфере а).
Методика определения
1. Готовят комплект пробирок, содержащих по 0,14 мл буфера а) и по 10 мкл
абсолютного этанола. К половине пробирок добавляют по 20 мкл
дезоксихолата, а к другой половине - по 20 мкл буфера а).
2. После обработки микросом зондом отбирают пробы, содержащие примерно по
2 мкг белка в 10 мкл, и переносят их в пробирки.
3. Начинают реакцию добавлением 20 мкл меченого паль-мнтоил-СоА. Через 2
мин останавливают ее добавлением
1,5 мл смеси изопропанол/гептан/вода (80:20:20, о/о). Оставляют
реакционную смесь на 5 мин.
4. Добавляют 1,0 мл гептана и 0,5 мл воды и перемешивают. Дают
разделиться двум фазам. Отбирают верхнюю фазу и промывают ее 0,05 М NaOH
в 50%-.ном этаноле для удаления пальмитиновой кислоты.
5. Отбирают пипеткой пробы из каждой гептановой фазы и вносят их во
флаконы сцинтилляционного счетчика. Испаряют растворитель в потоке азота,
добавляют сцинтиллятор и определяют радиоактивность образцов.
Латентность этанолацилтрансферазы равна
Расп./мин в гептановой фазе Расп./мин в гептаиовой фазе
в присутствии дезоксихолата в отсутствие дезоксихолата
-- . " , " ' * (/о)
Расп./мин в гептановой фазе в присутствии дезоксихолата
Как и в случае маннозо-6-фосфатазы, латентность этанол-ацнлтрансферазы в
непроницаемых микросомных везикулах превышает 90%.
5.2.4. Проницаемость других мембранных везикул
Используя подходы, подобные описанным выше, можно проконтролировать
целостность мембранных везикул, приготовленных из различных клеточных
органелл.
Высвобождение в инкубационную среду лактатдегидрогена-зы, растворимого
цитозольного фермента, свидетельствует о нарушении целостности выделенных
клеток. Аналогично можно использовать гемоглобин для контроля за
проницаемостью
182
Глава 4
мембраны эритроцитов. Определяя количество лактатдегидро-геназы,
захваченной везикулами при гомогенизации плазматических мембран, можно
судить о проницаемости полученных мембранных препаратов [27]. Препараты
мембран Гольджи содержат секретируемые белки, которые можно пометить, как
это описано для микросомных мембран, и затем с их помощью контролировать
целостность мембран [28]. В мембранах Гольджи содержится также
галактозилтрансфераза; с ее помощью тоже удается контролировать состояние
везикул точно так же, как с помощью маннозо-6-фосфатазы в случае мпкро-
сом [28].
5.3. Сохранение структурной организации Аликросоллных мембран
Сохраняется ли структура фосфолппидного бяслоя при экспериментальных
процедурах, используемых для установления топологической асимметрии
мембран? Ответить на этот вопрос очень трудно. Конечно, с помощью
электронной микроскопии срезов и сколов мембранных препаратов до и после
обработки зондом можно установить, сохраняет ли мембранный бислой свою
прежнюю организацию или в нем происходят сколько-нибудь значительные
структурные изменения. Однако этот метод ,не позволяет обнаружить
трансмембранную миграцию фосфолипидных молекул. Лучше всего было бы
исследовать с помощью одного и того же зонда как нормальные, так п
вывернутые везикулы. Если при дтом получатся согласующееся между собой
результаты, значит, структура мембраны не изменяется прн действии зонда.
Однако, как мы уже отмечали, препараты вывернутых непроницаемых везикул
удается надежно получать только из мембран эритроцитов.
В качестве компромиссного решения можно рекомендовать проводить
исследования трансмембранного распределения липидов с применением более
чем одного зонда, поскольку маловероятно, что различные воздействия,
оказываемые ими на липиды, будут вызывать одинаковые структурные
перестройки в мембране. В ходе контрольных экспериментов необходимо также
убедиться, что результаты, полученные на замкнутых везикулах, нельзя
объяснить специфичностью использованного зонда. Для этого мембранные
