Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
ориентацию: цитозольная сторона мембраны обращена наружу, а поверхность,
направленная в просвет цистерн эндоплазматического ретикулума, - внутрь.
К счастью для исследователей, все мембранные органеллы, выделяемые с
помощью обычных методов гомогенизации и центрифугирования, имеют
одинаковую ориентацию. Так, замкнутые органеллы, такие как лизоеомы,
пероксисомы и митохондрии, при выделении сохраняют ту морфологию, которую
они имели в клетке. Мембраны аппарата Гольджи выделяются в виде цистерн
или небольших везикул, обладающих такой же ориентацией, как и мембраны in
situ. В некоторых случаях бывает полезно иметь везикулы или с нормальной,
или с обратной ориентацией. Такие везикулы удается получить в случае
мембран эритроцитов; для других же мембран методы получения чистых
препаратов вывернутых непроницаемых везикул разработаны недостаточно.
5.2. Проницаемость микросомной мембраны
Проницаемость микросомной мембраны можно определить несколькими методами.
5.2.1. Высвобождение меченых белков из везикулярных цистерн
Шероховатый эндоплазматический ретикулум является местом синтеза
секретируемых белков. Новосинтезированные белки высвобождаются в просвет
цистерн. Секретируемые белки микросомных везикул, выделяемые из печени
крысы, можно пометить путем внутрнбрюшинной инъекции [14С]- или [3Н]-
лейцина (5 мкКи в 0,1 мл 0,14 М NaCI на 100 г живого веса) за 30 мин до
умерщвления животного и извлечения печени [24].
1. После обработки микросом зондом осаждают мембраны
центрифугированием (105 000 g в течение 30 мин), растворяют осадок и
образец исходных (необработанных) микросом в растворе для солюбилизации
тканей (например, в солуене
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
179
350 фирмы Packard Instruments или в растворе BTS 450 фирмы Beckman
Instruments).
2. Добавляют сцинтиллятор в соответствии с рекомендациями фирмы-
поставщика и определяют радиоактивность образцов.
3. Отбирают также пробы надосадочной жидкости, добавляют сцинтиллятор и
определяют радиоактивность этих образцов.
Доля меченых белков, Расп./мин в супернатанте
высвободившихся из Расп./мин в супернатанте+ '
микросом, /о +расп./мин в мембранах
Радиоактивность необработанных зондом мембран должна совпадать с
суммарной радиоактивностью мембранного осадка и надосадочной жидкости.
Следует провести также контрольные эксперименты, в которых микросомы
инкубируют без зонда и выделяют центрифугированием. Если доля белка,
высвободившегося из обработанных зондом мембран, выше, чем в случае
необработанных мембран, это означает, что целостность мембран нарушается
в присутствии зонда.
5.2.2. Латентность маннозо-6-фосфатазы
Глюкозо-6-фосфатаза, маркерный фермент эндоплазматичес-кого ретикулума
печени, состоит из двух компонентов - транс-феразы, которая осуществляет
транспорт глюкозо-6-фосфата через микросомную мембрану, и гидролазы,
локализованной на внутренней поверхности мембранных везикул. Трансфераза
обладает высокой специфичностью и не транспортирует манно-зо-6-фосфат,
тогда как гидролаза имеет низкую специфичность и может гидролизовать
маннозо-6-фосфат [25]. Таким образом, маннозо-6-фосфатазная активность
является латентной и проявляется только в проницаемых микросомных
везикулах. Эта латентность устраняется при обработке микросом
детергентами, например таурохолатом.
Определение активности маннозо-6-фосфатазы
Реагенты
а. Буфер 0,05 М трис-НС1, pH 7,4, содержащий сахарозу в концентрации 0,25
М.
б. 4%-ный таурохолат в буфере а).
в. 10 мМ маннозо-6-фосфат в буфере а).
г. 10%-ная трихлоруксусная кислота.
д. Растворы для определения фосфата (см. выше).
Методика определения
12*
180
Глава 4
1. После обработки микросом зондом отбирают пробы (0,1 мл, что
соответствует не более 500 мкг белка) и вносят их в два комплекта
пробирок, содержащих по 0,8 мл трис-бу-фера.
2. Добавляют по 0,1 мл таурохолата в пробирки одного комплекта и по 0,1
мл буфера в пробирки другого комплекта.
3. Помещают пробирки в водяную баню при 37 °С и, когда они нагреются до
этой температуры, добавляют по 0,1 мл раствора в) в каждую пробирку.
4. Останавливают реакцию через определенные промежутки времени в
интервале 0-15 мин добавлением 0,1 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты и
охлаждают пробирки во льду.
5. Осаждают белок в настольной центрифуге и отбирают по 0,5 мл
надосадочной жидкости.
6. Добавляют по 0,5 мл 2,5%-ного молибдата аммония и по 0,2 мл раствора
аминонафтолсульфокислоты, перемешивая после каждого добавления, как
описано в разд. 4.2, но опуская этап сжигания.
7. Прикрывают пробирки стеклянными шариками и прогревают их в кипящей
водяной бане в течение 9 мин. Охлаждают пробирки и измеряют оптическую
плотность при 830 нм. Определяют количество образовавшегося фосфата (в
мкмолях) по калибровочной кривой, построенной так, как описано ранее.
8. Активность маннозо-6-фосфатазы зависит от времени и от концентрации
белка. По линейному участку временной зависимости определяют число
