Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 83

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 77 78 79 80 81 82 < 83 > 84 85 86 87 88 89 .. 191 >> Следующая

везикулы следует сделать проницаемыми и, обработав их зондом, показать,
что в этих условиях фосфолипиды становятся полностью доступными.
5.3.1. Методы приготовления незамкнутых микросомных везикул
Микросомную мембрану можно сделать проницаемой несколькими способами. Об
их эффективности судят по высвобож-
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
183
дению содержимого везикул или по степени латентности манно-зо-6-фосфатазы
и этаноладилтрансферазы.
Обработка карбонатом натрия. Под действием этого агента нарушается
целостность микросомных везикул и происходит слияние их мембран с
образованием незамкнутых мембранных структур [29].
1. Ресуспендируют микросомы в концентрации менее 1 мг/мл (по белку) в 100
мМ карбонате натрия, pH 11,0. Оставляют суспензию на 30 мин во льду.
2. Осаждают микросомы центрифугированием при 105 000^ в течение 60 мин.
Если необходимо полностью отделить мембраны от надосадочной жидкости, в
которую переходит содержимое везикул, следует увеличить длительность
центрифугирования до 120 мин, затем ресуспендировать осадок мембран в
карбонате натрия и повторно центрифугировать суспензию для выделения
мембран.
3. Промывают осадок соответствующим буфером для удаления раствора
карбоната натрия перед ресуспендированием мембран для последующего
исследования.
Продавливание через пресс Френча. Эта процедура приводит к фрагментации
мембранных везикул и их разрушению [30].
1. Ресуспендируют микросомы в буфере, который предстоит использовать в
последующих исследованиях, в концентрации по белку 5 мг/мл.
2. Вносят суспензию в патрон пресса Френча п повышают давление до 1500
атм.
3. Оставляют суспензию на 5 мин для уравновешивания и осторожно открывают
вентиль, так чтобы мембранная суспензия вытекала со скоростью около одной
капли в секунду.
Суспензию, которая становится значительно прозрачнее после этой
обработки, можно использовать сразу же, без предварительного осаждения
мембран, поскольку ее концентрация является достаточной для проведения
дальнейших исследований.
Обработка детергентом. Мембраны можно сделать проницаемыми и прн
добавлении детергентов к суспензии микросомных везикул. Для этого
подходят таурохолат (0,4%), дезокси-холат (0,05%) и лизолецитин (0,005%).
Обработанный детергентами препарат можно сразу же использовать для
дальнейших исследований при условии, что зонд не теряет свою активность в
присутствии детергента.
Таким образом, микросомные мембраны можно сделать проницаемыми в щелочной
среде и при низком осмотическом давлении, механическом воздействии пли
действии детергентов. Эти методы пригодны в случае мембран аппарата
Гольджи, а также, вероятно, и других субклеточных фракций.
184
Глава 4
6. Определение трансмембранного распределения фосфолипидов с помощью
гидролитических ферментов
6.1. Общие принципы
Мембранные везикулы инкубируют в присутствии фосфоли-пазы и без нее в
условиях, при которых не нарушается целостность мембраны. Липиды
экстрагируют, отделяют фосфолипиды и определяют степень их гидролиза,
сравнивая обработанные и необработанные фосфолипазой мембраны.
6.2. Фосфолипазы
Фосфолипазы гидролизуют фосфолипиды по различным связям (рис. 4.7).
Фосфолипазы Aj и А2 отщепляют ацильные группы по положениям 1 и 2
глицеринового остатка, в результате
чего образуются соответствующие лизофосфолипиды. Фос-фолипаза С отщепляет
фосфо-рильный остаток, давая диа-цилглицеролы, а фосфолипа-за D отщепляет
этерифицирую-щую фосфат спиртовую группу с образованием фосфатидной
кислоты.
В принципе все эти ферменты можно использовать как зонды. Чтобы
определить их пригодность в каждом конкретном случае, необходимо
показать, что они не нарушают целостность исследуемых мембран. Для
микросомных мембран было показано, что фосфо-липазу С из Clostridium рег-
fringens и фосфолипазу D можно с успехом использовать в качестве зондов,
тогда как фосфолипаза С из Bacillus cereus и фос-фолипаза А из змеиного
или пчелиного яда нарушают целостность мембран.
Фосфолипазы поставляются различными фирмами (Sigma, Boehringer,
Worthington); рекомендуется использовать наиболее чистые препараты из
тех, что имеются в продаже. Обзор по фосфолипазам и методам их очистки
дан в работе [31].
6.3. Методика
1. Ресуспендируют мембранные везикулы в концентрации 5 мг/мл (по
белку) в буфере, который не нарушает их целостности. Для микросомных
мембран используют 0,14 М NaCI,
И,С - О - Р - О - СИ,- сн,
II о-
Рис. 4.7. Связи, по которым осуществляется гидролиз фосфолипидов под
действием фосфолипаз.
Разделение и анализ липидных компонентов мембран
185
pH которого доведен до 7,4 с помощью 0,05 М трис-НС1, 0,05 М фосфатного
буфера илн бикарбоната.
2. Для активации фосфолнпазы С необходимы ионы кальция. Их конечная
концентрация должна быть не ниже 0,25 мМ. Если же мембраны были выделены
или инкубированы в присутствии хелатирующего агента, концентрацию ионов
кальция следует повысить до 1 мМ.
3. К половине образцов добавляют фосфолипазу, так чтобы ее концентрация
Предыдущая << 1 .. 77 78 79 80 81 82 < 83 > 84 85 86 87 88 89 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed